Chemikalien und Reagenzien
GT wurde auf dem Markt in Taichung, Taiwan, gekauft. IS (Reinheit 97%) wurde von Alfa Aesar (Lancaster, UK) bezogen. 6,7-Dimethoxycumarin (6,7-DMC, Reinheit 98%) wurde von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, U.S.A.). EC (Reinheit 90%), ECG (Reinheit 98%), EGCG (Reinheit 95%), Ameisensäure, Probenecid, Phosphorsäure (eisig, 85%) und Methyl-Paraben wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.). EGC (Reinheit 92,7%) wurde von ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.), und Ethylacetat waren LC-Qualität und wurden von ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). Acetonitril war LC/MS-Qualität und wurde von Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.). Fötales Rinderserum wurde von Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penicillin-Streptomycin-Glutamin, Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Trypsin/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.) bezogen. Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 wurde von Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.) bezogen. 6-Carboxyfluorescein wurde von AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, U.S.A.) und 5-Carboxyfluorescein wurde von Acros Organics (Geel, Belgien) bezogen. Für alle Zubereitungen wurde Milli-Q plus Wasser (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) verwendet.
Zubereitung und Charakterisierung des GT-Aufgusses
Der Aufguss wurde hergestellt, indem entweder 2 oder 4 g GT in 50 mL heißem deionisiertem Wasser (98-100 °C) 30 Minuten lang eingeweicht wurden. Der Aufguss wurde in heißem Zustand mit Gaze filtriert, um Konzentrationen von 40 bzw. 80 mg/ml zu erhalten, die Ratten frisch über eine Magensonde verabreicht wurden.
Für die Charakterisierung des GT-Aufgusses wurden nach der Filtration des GT-Aufgusses mit einem 0,2 μm RC15-Filter (Sartorious, Göttingen) 100 μl des Filtrats mit 900 μl Methanol gemischt und zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen. Der ordnungsgemäß verdünnte Aufguss (50 μl) wurde mit 50 μl einer 6,7-DMC-Lösung (2,0 μg/ml in Methanol) als internem Standard kombiniert und 5 μl wurden einer LC-MS/MS-Analyse unterzogen. Das HPLC-System umfasste eine Accela 1250-Pumpe und einen Auto-Sampler (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Die chromatografische Trennung erfolgte mit einer analytischen Phenomenex® C18-Säule (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) mit Vorfilter. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril mit 0,01 % Ameisensäure (A) und Wasser mit 0,01 % Ameisensäure (B) und war wie folgt als Gradient programmiert: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) und 2/98 (12 min). Die Flussrate betrug 0,2 mL/min. Der Säulenausfluss wurde mit der H-ESI (heated-electrospray ionization) -II Sonde mit dem Quantum Access MAX Triple Stage Quadrupole (TSQ) Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.) nachgewiesen. Als Mantelgas wurde Stickstoff bei 35 willkürlichen Einheiten und als Hilfsgas bei 10 willkürlichen Einheiten verwendet. Die Kollisionsenergie wurde auf -19/18 V, die Sprühspannung auf -3000/3000 V, die Kapillartemperatur auf 350 °C, die Verdampfertemperatur auf 350 °C und der Versatz der Röhrenlinse auf -80/88 V eingestellt. Die folgenden Massenübergänge wurden für die Analyse der ausgewählten Reaktionsüberwachung (SRM) verwendet: EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) und 6,7-DMC (207/151). Die ESI-MS-Spektren wurden im Negativ-Ionen-Modus für EC, EGC, ECG und EGCG und im Positiv-Ionen-Modus für 6,7-DMC aufgenommen.
Tiere
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (270-360 g) wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) erworben und in einer konditionierten Umgebung mit 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht. Nahrung und Wasser wurden bis 12 Stunden vor den Experimenten ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Ratten wurden in zwei Gruppen aufgeteilt. Im ersten Experiment wurden 28 Ratten verwendet, um die Wirkung von GT auf die Serumspiegel von IS und PCS bei CRF-Ratten zu bestimmen; im zweiten Experiment wurden 14 Ratten verwendet, um die Wirkung von GT auf die Nierenfunktion von CRF-Ratten zu bewerten. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des „Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren (2002)“ durchgeführt, der von der Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C. veröffentlicht wurde. Das Versuchsprotokoll wurde am 08.01.2014 (Genehmigungsnummer: 103-126-N) vom Insitutional Animal Care and Use Committee der China Medical University, Taiwan, R.O.C., geprüft und genehmigt.
Einrichtung des CRF-Modells und Verabreichung der GT-Infusion
CRF wurde durch orale Verabreichung von Adenin in Anlehnung an frühere Studien, jedoch mit einigen Modifikationen, induziert19,23,35,36. Adenin, suspendiert in 0,5%iger Methylcellulose 400 (15 mg/ml), wurde 28 Ratten zweimal täglich über die Magensonde oral verabreicht, und zwar in sieben aufeinanderfolgenden Dosen (15 mg/Ratte) während des gesamten Versuchszeitraums. Am 4. Tag wurden die Serumspiegel von IS bestimmt. Nach der Bestätigung einer abgeschwächten Nierenfunktion durch einen signifikanten Anstieg der IS-Serumspiegel wurden die CRF-Ratten in drei Gruppen (8-10 Ratten in jeder Gruppe) mit vergleichbaren IS-Spiegeln aufgeteilt. Die erste Gruppe erhielt zweimal täglich 400 mg/5 mL/kg GT-Infusion in sieben aufeinanderfolgenden Dosen; die zweite Gruppe erhielt zweimal täglich 200 mg/5 mL/kg GT in sieben aufeinanderfolgenden Dosen; und die dritte Gruppe erhielt parallel dazu 5 mL/kg Wasser als Kontrolle. Am 8. Tag wurde den Ratten die siebte Dosis GT um 9.00 Uhr morgens nach dem Fasten über Nacht verabreicht, und die Blutproben wurden 0, 15, 30, 60, 120, 180 und 360 Minuten nach der Verabreichung entnommen. Die geplanten Zeitpunkte der Blutentnahme und der Verabreichung von Adenin und GT sind in Abb. 3 zusammengefasst. Zu jedem Entnahmezeitpunkt wurden 0,5 ml Blut unter Isofluran-Narkose entnommen. Die Blutproben wurden in Mikroröhrchen gesammelt und 15 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen, das vor der Analyse bei -20 °C gelagert wurde.
Bestimmung der IS- und PCS-Konzentrationen im Serum
Für die Bestimmung der IS- und PCS-Konzentrationen im Serum wurden 50 μl der Serumprobe mit 200 μl Methanol, das 10 μg/ml 6,7-DMC bzw. 100 μg/ml Methylparaben als interne Standards enthielt, verwirbelt und zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen, dann wurde ein Aliquot von 20 μl der HPLC-Analyse unterzogen.
Für Kalibratorpräparate wurden 50 μL Serum mit einer Reihe von Konzentrationen von IS und PCS versetzt, um Konzentrationsbereiche von 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) bzw. 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM) zu erhalten. Das spätere Verfahren entsprach dem oben für Serumproben beschriebenen. Die Kalibrierkurven wurden durch lineare Regression der Peakflächenverhältnisse (IS oder PCS zu internem Standard) gegen die bekannten Konzentrationen von IS bzw. PCS erstellt.
Das HPLC-Gerät umfasste eine Pumpe (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japan), einen Fluoreszenzdetektor (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) und einen automatischen Injektor (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japan). Die Apollo-C18-Säule (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) war mit einer Guardsäule (4,6 × 50 mm, 5 μm) ausgestattet (GL Science Inc., Tokio, Japan). Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A)-0,1 % Phosphorsäure (B) und wurde in einem Gradienten wie folgt programmiert A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) und 15/85 (24-35 min) für IS und 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) und 16/84 (24-36 min) für PCS. Die Detektoreinstellungen waren Ex 280 nm/Em 375 nm für IS und Ex 214 nm/Em 306 nm für PCS. Die Flussraten betrugen 1,0 mL/min.
Wirkung von GT auf Cr und BUN bei CRF-Ratten
In einem weiteren Experiment wurde das gleiche Tierprotokoll wie oben erwähnt verwendet und die Konzentrationen von Cr und BUN wurden vor der Adeninbehandlung (Tag 0), vor der GT-Dosierung (Tag 4) und nach der siebten GT-Dosis (Tag 8) bestimmt. Nach der Bestätigung einer abgeschwächten Nierenfunktion durch einen signifikanten Anstieg von Cr und BUN an Tag 4 wurden die CRF-Ratten in zwei Gruppen (7 Ratten pro Gruppe) mit vergleichbaren Cr-Werten aufgeteilt. Die erste Gruppe erhielt zweimal täglich 400 mg/5 mL/kg GT in sieben aufeinanderfolgenden Dosen; die zweite Gruppe erhielt parallel dazu 5 mL/kg Wasser als Kontrolle. Am 8. Tag wurde den Ratten die 7. Dosis GT und Wasser verabreicht, nachdem sie über Nacht gefastet hatten, und die Blutproben wurden 30 Minuten später entnommen. Cr wurde mit einer kinetischen alkalischen Pikratmethode in einem ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.) bestimmt. BUN wurde durch die Urease/Glutamat-Dehydrogenase-gekoppelte Enzymreaktion mit demselben Analysegerät bestimmt.
Zelllinie und Kulturbedingungen
Die Konstruktion der stabil transfizierten Zelllinien, die für die Transportstudien verwendet wurden, nämlich Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die hOAT1 (CHO-hOAT1) exprimieren, Zellen der humanen embryonalen Niere 293 (HEK), die hOAT3 (HEK-hOAT3) exprimieren, und die entsprechenden Kontrollzelllinien, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden, wurde bereits beschrieben40,41. CHO-Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in DMEM F-12-Medien (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) mit 10 % Serum, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 mg/mL G418 gehalten. HEK-Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in DMEM-Hochglucosemedien (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) gehalten, das 10 % Serum, 1 % Penicillin/Streptomycin und 50 μg/mL Hygromycin B enthielt. Die Zellen wurden in mit Poly-D-Lysin beschichteten Schalen kultiviert.
Zubereitung und Charakterisierung der Serummetaboliten von GT (GTM)
Um die Moleküle zu imitieren, die in vivo mit OATs interagieren, wurden GTM aus Ratten hergestellt und charakterisiert. Kurz gesagt wurde Ratten, die über Nacht gefastet hatten, eine GT-Infusion (800 mg/10 mL/kg) oral verabreicht. 15 Minuten nach Verabreichung der GT-Infusion wurde Blut abgenommen. Nach der Gerinnung wurde das Serum gesammelt und mit 3-fachem Methanol vortexiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 10.000 g wurde der Überstand in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum bis zur Trockne konzentriert. Dem Rückstand wurde ein angemessenes Volumen Wasser zugesetzt, so dass eine Lösung mit der 10-fachen Serumkonzentration entstand, die in Aliquots aufgeteilt und bei -80 °C für die spätere Verwendung aufbewahrt wurde.
Ein Teil der GTM wurde nach einer früheren Methode mit einigen Änderungen charakterisiert16,46. Kurz gesagt wurden 100 μL der Serumprobe mit 50 μL Sulfatase (mit 1000 Einheiten/mL Sulfatase und 39.861 Einheiten/ml ß-Glucuronidase) und 50 μL Ascorbinsäure (200 mg/mL) gemischt und 45 Minuten lang bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Nach der Hydrolyse wurde das Serum mit 50 μl 0,1 N HCl versetzt und dann mit 250 μl Ethylacetat (das 100 ng/ml 6,7-DMC als internen Standard enthält) getrennt. Die Ethylacetatschicht wurde unter N2 bis zur Trockene eingedampft und vor der LC-MS/MS-Analyse mit einem angemessenen Volumen der mobilen Phase wiederhergestellt. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A) – Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (B) und wurde in einem Gradienten wie folgt programmiert: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) und 2/98 (12 min). Die Flussrate betrug 0,2 mL/min.
Auswirkungen von GTM auf den durch hOAT1 und hOAT3 vermittelten Aufnahmetransport
CHO-hOAT1- und HEK-hOAT3-Zellen (1 × 105 Zellen/Well) wurden in einer 96-Well-Platte kultiviert. 6-Carboxyfluorescein (6-CF) und 5-Carboxyfluorescein (5-CF) wurden als Sonden für die Bewertung der Wirkung von GTM auf die Aktivität von hOAT1 bzw. hOAT3 verwendet47,48. Darüber hinaus wurde Probenecid (80 μM) als Positivkontrolle für die Hemmung von hOAT1 und hOAT349 verwendet. Nach 24 bzw. 48 Stunden Inkubation von CHO-hOAT1 oder HEK-hOAT3 wurde das Medium entfernt und dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. Vor dem Transportexperiment wurden CHO-hOAT1- und HEK-hOAT3-Zellen mit den Teststoffen (GTM und Probenecid) bei 37 °C vorinkubiert. Nach 30 Minuten Inkubation wurde dann 6-CF oder 5-CF zugegeben und weitere 5 bzw. 10 Minuten inkubiert. Die Platten wurden sofort auf ein Eisbad gestellt, der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden 100 μl 0,1 % Triton X-100 hinzugefügt, um die Zellen zu lysieren, und die Fluoreszenz wurde mit einer Anregung bei 485 nm und einer Emission bei 528 nm gemessen. Zur Quantifizierung des Proteingehalts in jeder Vertiefung wurden 10 μl Zelllysat zu 200 μl verdünntem Proteinassay-Reagenz (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) hinzugefügt und die optische Dichte bei 570 nm gemessen. Die relative intrazelluläre Akkumulation von 6-CF oder 5-CF wurde durch Vergleich mit der der Kontrollen nach Proteinkorrektur berechnet.
Datenanalyse
Die Serumspitzenkonzentration (Cmax) wurde aus experimentellen Beobachtungen gewonnen. Die Fläche unter der Serumkonzentrations-Zeit-Kurve (AUC0-t) wurde mit Hilfe der Trapezregel bis zum letzten Punkt berechnet. Die Unterschiede von IS und PCS zwischen den drei Gruppen wurden mit Hilfe einer einseitigen ANOVA analysiert, während der Unterschied von Cr und BUN zwischen zwei Gruppen mit Hilfe eines ungepaarten Student’s t-Tests analysiert wurde, wobei p < 0,05 als signifikantes Niveau angenommen wurde. Der ungepaarte Student’s t-Test wurde auch für die Analyse der In-vitro-Tests verwendet.