In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass unterschiedliche Methoden der RNA-Isolierung die Ergebnisse bei der Analyse der Genexpression in Geweben beeinflussen werden. Die RNA-Extraktionsmethoden lassen sich grob in eine Phenol:Chloroform-Extraktion mit anschließender Alkoholausfällung (TRIzol), eine Phenol:Chloroform-Extraktion mit anschließender Festphasenextraktion (säulenbasiert; miRVana und miRNeasy) und eine Festphasentrennung mit/ohne Affinitätsharz (Norgen total und Isolate II) unterteilen. Diese Methoden wurden in erster Linie für die Extraktion langer mRNAs entwickelt und beruhen auf der Annahme, dass alle RNAs gleichermaßen gereinigt werden. Bei der Wahl einer bestimmten RNA-Extraktionsmethode spielen außerdem eine Reihe von Faktoren eine Rolle, wie z. B. die Qualität, die Menge, der Preis und die Benutzerfreundlichkeit (Zeit bis zur Extraktion). Wir stellen hier Daten vor, die zeigen, dass die zur RNA-Extraktion verwendete Methode im Vergleich zu anderen Methoden bei nachgeschalteten Anwendungen ebenfalls zu unterschiedlichen Ergebnissen führt und daher eine weitere wichtige Überlegung darstellt.
Diese Studie zeigt, dass sich die Methoden zur RNA-Isolierung in Bezug auf die Quantität und Qualität der RNA-Proben sowie bei der Analyse der miRNA- und Zielgenexpression unterscheiden. Wir haben Organe ausgewählt, aus denen die RNA-Isolierung aus verschiedenen Gründen schwierig sein kann. Bei der RNA-Isolierung aus dem Gehirn beispielsweise ist die Ausbeute aufgrund des hohen Lipidgehalts oft gering. Dies war bei dem Bioline Isolate II Kit besonders offensichtlich. Das Herstellerprotokoll schlägt vor, dass bis zu 5 μg RNA aus 10 mg Ratten-/Mausgehirn aufgereinigt werden sollten. Im miRNeasy-Handbuch heißt es jedoch, dass mit der gleichen Menge an Ausgangsmaterial 5-20 μg RNA aus Gehirn gewonnen werden können. In der Fehlerbehebung auf der Website des Herstellers wird als ein Problem bei lipidreichem Gewebe die Verstopfung der Säule beschrieben, und es wird vorgeschlagen, die Probenmenge zu verringern oder das Volumen des Lysepuffers zu erhöhen. Unsere Extraktionen wurden innerhalb der im Protokoll vorgeschlagenen Grenzen durchgeführt. Anschließend wird vorgeschlagen, eine Vorextraktion mit TRIsure-Reagenz (Biolines Äquivalent zu TRIzol) und dann eine säulenbasierte Trennung mit dem Kit durchzuführen, um die wässrige Phase zu reinigen. Diese Methode wäre dann mit den miRVana- und miRNeasy-RNA-Extraktionsmethoden vergleichbar und könnte zu einer besseren Ausbeute für dieses Gewebe führen. Darüber hinaus korreliert die RNA-Qualität mit gewebespezifischen Reaktionen auf physiologischen Stress sowohl vor als auch nach dem Gewebetod. Gewebe wie Lunge und Leber haben typischerweise niedrige RINs und einen kleinen 28S-Peak, da diese Gewebe für einen schnelleren RNA-Abbau durch hohe Nukleasenmengen anfällig sind. Um Nukleasen zu inaktivieren, wird das Gewebe schnell eingefroren und das Auftauen verhindert, bis das gewogene Material dem Extraktionspuffer zugegeben wird. Obwohl das Auftauen des Gewebes verhindert wurde, können wir nicht ausschließen, dass die Zeit von der Euthanasie des Tieres und der Exzision der Organe bis zum schnellen Einfrieren ein Faktor ist, der zu den insgesamt niedrigen RIN-Werten und einigen Abbauprodukten beiträgt, die bei allen Lungenproben, unabhängig vom verwendeten Isolierungskit, beobachtet wurden. Eine alternative Methode zur Inaktivierung von Nukleasen ist die Verwendung einer RNA-stabilisierenden Lösung wie RNAlater (ThermoFisher Scientific), mit der ungefrorene Gewebeproben später verarbeitet werden können. Sie kann dazu beitragen, die Integrität der RNA zu gewährleisten, ist jedoch nicht mit allen RNA-Isolierungsverfahren kompatibel, und die Benutzer sollten sich vor der Durchführung von Extraktionen über ihre spezifische Methode informieren. Das Auftreten eines Peaks nach 60 s in einigen Proben in der Bioanalyser-Analyse deutet auf eine gDNA-Kontamination hin. Bei einigen Kits kann eine zusätzliche DNase-Behandlung auf den Säulen durchgeführt werden, jedoch wird ein gDNA-Eliminierungsschritt während der reversen Transkription dringend empfohlen. Die Einbeziehung dieses Schritts in unsere Methoden könnte erklären, warum bei der Analyse der mRNA-Expression der Norgen-Lungenproben keine Interferenzen auftraten, jedoch hatte er Auswirkungen auf die miRNA-Expressionsanalyse, da das Taqman miRNA-Assay-Protokoll keine gDNA-Entfernung vorsieht. Darüber hinaus ist die Reinheit der RNA-Proben ein kritischer Faktor, denn obwohl Proben mit einer RIN > 7 in den meisten nachgeschalteten Anwendungen gut funktionieren sollten, können Proben, die enzymatische Reaktionen wie qPCR beinhalten, durch Nukleasen, Metallionen oder organische Verunreinigungen gehemmt werden. Im Allgemeinen wiesen die Bioline Isolate II RNA-Proben niedrigere 260/230-Verhältnisse auf, und Verunreinigungen könnten zu ihrer schlechten Leistung beitragen. Schließlich wurden auch Unterschiede bei der Anreicherung von miRNAs in der Gesamt-RNA-Präparation festgestellt. Da miRNAs nur einen kleinen Teil des gesamten RNA-Repertoires ausmachen, kann es schwierig sein, ihren Beitrag anhand der Integritätsanalyse zu bestimmen. Der Qubit microRNA-Assay bietet einen hochselektiven Nachweis geringer Mengen kleiner RNAs, selbst bei Vorhandensein üblicher Verunreinigungen. Mit den miRVana- und Norgen-Extraktionsmethoden wurden in der Regel hohe Prozentsätze an miRNAs nachgewiesen. Angesichts der Integritätsanalyse für Norgen-Gesamt-RNA-Präparate ist es jedoch möglich, dass die miRNA-Anreicherung überschätzt wird, da kleinere RNA-Fragmente infolge des Abbaus oder der Oxidation größerer RNAs (mRNAs, rRNAs oder tRNAs) oder, im Falle der Lungenproben, DNA-Kontaminationen nachgewiesen werden, die die Qubit-Ergebnisse stören. Daher sind Menge, Qualität und Reinheit der RNA-Proben äußerst wichtige Faktoren für die Wahl einer bestimmten RNA-Extraktionsmethode, und weitere Forschungsarbeiten zur Optimierung dieser Methoden für das betreffende Gewebe können zu deren Verbesserung beitragen.
Das Profiling von miRNAs kann Aufschluss über Biomarker für diagnostische oder prognostische Anwendungen geben. So können beispielsweise miRNA-Panels zur Klassifizierung verschiedener Krebsphänotypen, zur Vorhersage des Wiederauftretens oder des Ansprechens auf Therapien verwendet werden. Für die Entdeckung und klinische Anwendung von miRNA-basierten Biomarkern bedarf es jedoch optimierter und standardisierter Verfahren für die RNA-Extraktion, um widersprüchliche Ergebnisse zu vermeiden. Eine Meta-Analyse von 63 veröffentlichten Studien durch Zhou et al. (2014) ergab beispielsweise widersprüchliche und sogar gegensätzliche Ergebnisse bei der Bewertung des prognostischen Werts der oncomiR, miR-21 . Die Autoren führen die Heterogenität auf Unterschiede bei der Herkunft der Proben, den Nachweismethoden und den Normalisierungsmethoden zurück, spielten aber nicht auf die Methoden zur RNA-Extraktion an, die, wie wir zeigen, ebenfalls dazu beiträgt.
Die biologischen Funktionen und Ziele von nur sehr wenigen miRNAs sind experimentell validiert worden, was jedoch entscheidend ist, um das Potenzial einer miRNA-basierten Therapie zu realisieren. Darüber hinaus wird die Aufdeckung gewebespezifischer biologischer Funktionen dazu beitragen, ihre therapeutische Wirkung und mögliche Off-Target-Effekte in normalem Gewebe zu identifizieren. Die Validierung von miRNA-mRNA-Interaktionen erfolgt in erster Linie in Zellkulturtests, bei denen die endogenen miRNAs künstlich manipuliert werden. Die durch Zellkulturmanipulationen (z. B. Transfektion von Mimics) erzielten Spiegel entsprechen jedoch in der Regel nicht den in vivo beobachteten physiologischen Spiegeln, weshalb es wichtig ist, die Ergebnisse in geeigneten Tiermodellen zu rekapitulieren. Bisher gibt es keine Berichte, in denen der Nachweis von miRNA und Zielgenen aus Gesamt-RNA-Proben mit verschiedenen Extraktionsmethoden direkt verglichen wurde. Wir zeigen, dass sich die RNA-Extraktionsmethoden in ihrer Effizienz bei der Isolierung von kurzen und langen RNAs unterscheiden. Daher muss die Wahl einer geeigneten Methode sorgfältig überlegt werden, wenn man beide aus derselben Probe nachweisen möchte.
In der bisherigen Forschung wurde allgemein davon ausgegangen, dass alle Arten von RNA gleich gereinigt werden. Es gibt jedoch mehrere Berichte, die auf Unterschiede in der Extraktionseffizienz je nach der für die RNA-Isolierung verwendeten Methode hinweisen. Kim et al. (2011) zogen ihre Arbeit in Molecular Cell zurück, da sie feststellten, dass ihre Schlussfolgerungen zu Unterschieden in der miRNA-Expression von Zellen, die bei unterschiedlichen Konfluenzgraden (hohe Dichte gegenüber niedriger Dichte) gezüchtet und von der Kulturschale abgelöst wurden (adhärent gegenüber Suspension), tatsächlich auf Unterschiede in der RNA-Extraktionseffizienz bei der TRIzol-Methode zurückzuführen waren. Sie fanden heraus, dass miRNAs mit niedrigem GC-Gehalt und stabiler Sekundärstruktur während der Extraktion verloren gingen und nicht, wie ursprünglich veröffentlicht, in den Zellen abgebaut wurden. Frühere Ergebnisse von El-Khoury et al. (2016) fanden Unterschiede in der miRNA-Gewinnung aus Zellen, Plasma und aus Urin/Plasma gewonnenen Exosomen beim Vergleich von TRIzol LS, miRNeasy Serum/Plasma und miRCURY Biofluid-Extraktionskits. Die Autoren stellten fest, dass mit dem miRCURY-Kit hochreine RNA isoliert, aber miRNAs nur in geringem Maße gewonnen werden konnten. TRIzol lieferte RNA von geringer Reinheit, was sich auf die PCR-Effizienz auswirkte, während miRNeasy RNA von schlechter Qualität lieferte, aber die besten Ergebnisse beim Nachweis von miRNAs erzielte. Ebenso fanden McAlexander et al. (2013) Unterschiede bei der miRNA-Extraktion aus Plasma und Liquor. Sie verglichen miRVana, miRCURY Cell and Plant Kit und TRIzol LS Extraktionen mit und ohne Glykogen als Träger. miRVana war mit und ohne Glykogen ähnlich, während miRCURY ohne Glykogen eine etwas geringere miRNA-Gewinnung als miRVana aufwies. Glykogen verbesserte jedoch die miRNA-Gewinnung mit dem miRCURY-Kit erheblich, verschlimmerte jedoch die geringe Ausbeute und Variabilität bei der TRIzol-Extraktion. Anschließend verglichen sie den miRCURY-Kit für Zellen und Pflanzen mit den Extraktionsmethoden miRCURY Biofluids und miRNeasy für Serum/Plasma mit Glykogen als Träger und stellten fest, dass miRCURY Biofluids die höchste relative Abundanz an aufgestockter exogener miRNA aufwies. Insgesamt unterstreichen diese Studien die Unterschiede bei der RNA-Gewinnung mit verschiedenen Extraktionsmethoden und legen nahe, dass eine Optimierung für die jeweilige Zelle, das Gewebe und/oder die Flüssigkeit von Interesse erforderlich ist.
Es gibt mehrere Schritte während des Arbeitsablaufs, die zu experimentellen Abweichungen führen können. Angefangen bei der Methode zum Fixieren oder Einfrieren des Gewebes, der Lagerung des Materials, der RNA-Extraktionsmethode, der Methode zur reversen Transkription und qPCR-Amplifikation oder anderen nachgeschalteten Plattformen. In dieser Studie haben wir versucht, einige dieser Variablen zu kontrollieren, indem wir die Gewebe tiefgefroren, bei – 80 °C gelagert, vor der Extraktion nicht aufgetaut und die am meisten empfohlenen Verfahren für die miRNA-Expressionsanalyse verwendet haben. So hat sich z. B. die Verwendung sequenzspezifischer RT-Primer im Gegensatz zu universellen RT-Primern als besser für die spezifische Produktamplifikation erwiesen. qPCR gilt aufgrund ihrer Sensitivität und Spezifität gegenüber globalen Profiling-Plattformen als Goldstandard für die Analyse der miRNA- und Target-Expression. Wichtig ist, dass die Qualität der erzielten Ergebnisse wichtiger ist als die bloße Anzahl der miRNAs, die von großen sequenzbasierten Plattformen profiliert werden. Auch wenn wir die Wirkung der miRNA-Anreicherung unserer RNA-Proben nicht verglichen haben, wurde in früheren Berichten davon abgeraten, insbesondere bei globalen miRNA-Profilierungsplattformen. So fanden Redshaw et al. (2013) beispielsweise heraus, dass das Verfahren der Anreicherung kurzer RNA zu deutlich geringeren relativen miRNA-Spiegeln führt, wenn man die Gesamt-RNA mit angereichertem Material vergleicht, und zwar reduzierte das Anreicherungsverfahren die Kopienzahl der miRNAs um bis zu 25 % derjenigen, die in den vorangereicherten Proben vorhanden war, und dass dieser Verlust für verschiedene miRNA-Sequenzen variierte. Daher sind die miRNA-Daten aus Gesamt- und Kurz-RNA-Präparaten möglicherweise nicht direkt vergleichbar. Außerdem wurde vermutet, dass größere RNAs als Träger für kleine RNAs fungieren können. Ob miRNA-angereicherte Methoden für alle Unternehmen zu einer besseren Gewinnung aus Geweben führen würden, muss noch ermittelt werden. Obwohl Bioline ein separates Kit für die miRNA-Isolierung vorschlägt, haben wir das Isolate II Gesamt-RNA-Kit verwendet, um einen direkten Vergleich mit anderen Extraktionsmethoden anzustellen, da das miRNA-spezifische Kit keine Isolierung von kurzen und langen RNAs aus derselben Elution ermöglicht. Vielmehr werden zuerst die miRNA-Spezies angereichert und isoliert, und danach können die langen RNAs extrahiert werden, was zu zwei separaten Fraktionen führt. Obwohl das Isolate II nicht für die Isolierung kleiner RNAs optimiert ist wie die miRVana- oder miRNeasy-Kits, war es auch für die Zielgenexpression nicht überlegen. Angesichts der großen Diskrepanz zwischen bestimmten Kits sollten sich Forscher für eine robustere Extraktionsmethode entscheiden.