Anfängliche ProblemeBearbeiten
ThermolabilitätBearbeiten
Die anfängliche Anwendung der FLP-FRT-Rekombinase hat in Säugetieren nicht funktioniert. Das FLP-Protein war thermolabil (denaturiert bei erhöhten Temperaturen) und war daher im Säugetiermodell aufgrund der erhöhten Körpertemperaturen dieser Modellsysteme nicht brauchbar. Aufgrund von Patenten und Einschränkungen bei der Verwendung der Cre-Lox-Rekombination wurde jedoch großes Interesse an der Herstellung einer thermostabileren FLP-FRT-Kassette gezeigt. Einige der ersten Ergebnisse wurden von Buchholz et al. (1997) mit Hilfe der zyklischen Mutagenese in Escherichia coli erzielt. In ihren Untersuchungen transfizierten die Autoren E. coli-Zellen mit zwei Plasmiden: eines, das für zufällig mutierte FLP-Proteine kodiert, die einem Arabinose-Promotor nachgeschaltet sind, und ein anderes, das einen lacZ-Genpromotor innerhalb einer FRT-Kassette enthält. Die E. coli wurden auf Arabinose-Platten bei 37 °C und 40 °C kultiviert, und wenn es zu einer Rekombination kam, wurde die lacZ-Expression abgeschwächt, und die Kolonien erschienen weiß. Aus jeder Generation wurden weiße Kolonien ausgewählt und acht Generationen lang auf neuen Arabinose-Platten bei denselben Temperaturen wie zuvor gezüchtet. Nachdem die Rekombination durch Western-Blotting bestätigt und die mutierten FLP-Gene sequenziert worden waren, wurde dieses FLP-Protein der achten Generation (FLPe) in Säugetierzellkulturen transfiziert, und die Rekombination in Säugetierzellen wurde bestätigt. Diese FLP-Variante weist nur 4 Aminosäure-Substitutionen auf: P2S, L33S, Y108N und S294P.
Erzeugung von genetischen MosaikenEdit
Genetischer Mosaizismus tritt innerhalb eines Organismus auf, wenn ähnliche Zelltypen aufgrund unterschiedlicher Genotypen an bestimmten Loci unterschiedliche Phänotypen aufweisen. Vereinfacht ausgedrückt, handelt es sich um einen Vorgang, bei dem ein Organismus verschiedene Genotypen enthält, was in der Natur normalerweise selten vorkommt. Dies kann jedoch durch FLP-FRT-Rekombination leicht (und problematisch) erzeugt werden. Wenn in einer Zelle zwei verschiedene FRT-Stellen vorhanden sind und FLP in geeigneter Konzentration vorhanden ist, wird die FRT-Kassette weiter ausgeschnitten und zwischen den beiden FRT-Stellen eingefügt. Dieser Prozess wird so lange fortgesetzt, bis die FLP-Proteine unter die erforderlichen Konzentrationen fallen, was dazu führt, dass Zellen innerhalb eines Organismus unterschiedliche Genotypen besitzen. Dieser Vorgang wurde von der Fruchtfliege bis zur Maus beobachtet und ist unterschiedslos gegen bestimmte Chromosomen (somatisch und geschlechtlich) oder Zelltypen (somatisch und Keimbahn) gerichtet.
Bestimmung von ZelllinienBearbeiten
Vor der Veröffentlichung von Dymecki et al. (1998) wurde Cre-Rekombinase für die Kartierung des Zellschicksals von neuronalen Vorläufern in Mäusen unter Verwendung des En2-Promotors verwendet. Daher stellten die Autoren von Dymecki et al. (1998) die Theorie auf, dass die FLP-Rekombinase in ähnlicher Weise und mit ähnlicher Wirksamkeit wie die Cre-Rekombinase bei Mäusen eingesetzt werden könnte. Die Autoren schufen zwei transgene Mauslinien: eine neuronale Wnt1::Flp-Fusionslinie und eine Linie, die die FRT-Kassette besitzt, die das 18. Exon von tm1Cwr flankiert. Exon von tm1Cwr flankierte. Die Autoren wählten dieses Exon für die Exzision aus, weil es bei Exzision zu einem Null-Phänotyp führt. Die Autoren verpaarten die beiden Linien und ließen die Nachkommenschaft das Erwachsenenalter erreichen, bevor die Nachkommen geopfert wurden. Die RNA-Extraktion wurde aus neuronalem, muskulärem, enterischem und Schwanzgewebe durchgeführt. Reverse-Transkriptions-PCR und Northern Blotting bestätigten die Exzision des 18. Exons von tm1Cwr reichlich im Gehirngewebe und mäßig im Muskelgewebe (aufgrund von Scwhann-Zellen im Muskel). Wie erwartet, wurde die Exzision in anderen Geweben nicht beobachtet. Die Autoren sahen eine gleichwertige, wenn nicht sogar bessere Effizienz der FLP-Rekombinase bei der Bestimmung des Zellstatus als die Cre-Rekombinase.
In Drosophila melanogaster (Fruchtfliege)
Bislang wurde die Flp-Rekombinase mehrfach in D. melanogaster eingesetzt. Ein Vergleich von Flp-Rekombinase mit Cre-Rekombinase in D. melanogaster wurde von Frickenhaus et al. (2015) veröffentlicht. Die Autoren von Frickenhaus et al. (2015) verfolgten zwei Ziele: Charakterisierung und Vergleich der Wirksamkeit von Flp-Rekombinase-„Knock-out“ mit Cre-Rekombinase-„Knock-out“ und RNAi-Knockdown sowie Aufdeckung der Funktion von cabeza (caz), dem Fliegenortholog von FUS, in den Neuronen und im Muskelgewebe von D. melanogaster. FUS spielt eine wichtige Rolle bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und der frontotemporalen Demenz beim Menschen. Die Autoren verwendeten ein elav-Gal4/UAS-Flp- oder Cre-System, um die Rekombinase spezifisch in Neuronen zu exprimieren, und ein Mef2-Gal4/UAS-Flp- oder Cre-System, um sie spezifisch in Muskeln zu exprimieren. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass das Flp-Rekombinase-„Knock-out“-Werkzeug effektiver ist als RNAi und Cre-Rekombinase, wenn es darum geht, bestimmte Gene in bestimmten Geweben oder Zelllinien auszuschalten, da die undichte Expression fehlt, die sowohl beim Cre-Protein als auch beim RNAi-Transkript auftritt. Außerdem beobachteten die Autoren eine Toxizität des Cre-Proteins, die bei dem Flp-Protein nicht auftritt.
In Danio rerio (Zebrafisch)
Die Wirksamkeit des FLPe-Rekombinasesystems wurde von Wong et al. (2009) in Zebrafischen untersucht. Embryonen, die hemizygot für ein FRT-flankiertes Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) stromabwärts eines muskelspezifischen Promotors waren, wurden mit dem FLPe-Protein injiziert. Ohne FLPe sollten diese Embryonen EGFP im gesamten Muskelgewebe exprimieren, und wenn sie mit einem Wildtyp-Strang gekreuzt werden, sollten 50 % der resultierenden Nachkommenschaft ebenfalls EGFP im Muskelgewebe exprimieren. Embryonen, denen FLPe injiziert wurde, wiesen eine deutlich verringerte Expression von EGFP im Muskelgewebe auf, und es wurde auch Mosaizismus beobachtet. Als diese Embryonen das Erwachsenenalter erreichten, wurden sie mit einem Wildtyp-Stamm verpaart, und die daraus resultierenden Gelege hatten deutlich weniger Nachkommen, die EGFP im Muskelgewebe exprimierten (0-4 %). Diese Ergebnisse zeigen, dass FLPe nicht nur in somatischen Zellen, sondern auch in der Keimbahn von Zebrafischen hochwirksam ist,
In PflanzenEdit
Schaffung von „Phytosensoren“ oder „Sentinels“ in Arabidopsis thaliana und TabakEdit
Phytosensoren sind gentechnisch veränderte Pflanzen, die das Vorhandensein von biotischen oder abiotischen Schadstoffen melden können. Es liegt auf der Hand, dass die Herstellung dieser gentechnisch veränderten Pflanzen in der Landwirtschaft und im Labor vielversprechend ist. Die Entwicklung eines geeigneten Reportervektors hat sich jedoch als problematisch erwiesen. cis-regulatorische Elemente spielen eine wichtige Rolle bei der Transkriptionsaktivierung von Genen in Pflanzen, und viele von ihnen sind nicht gut verstanden. Viele Phytosensoren exprimieren ihre Reportergene entweder nicht ausreichend oder zeigen aufgrund synthetischer Promotoren falsch-positive Ergebnisse an. Die Autoren von Rao et al. (2010) nutzten das FLP-Rekombinase-Tool für die Herstellung eines hocheffizienten Phytosensors. Die Autoren verwendeten einen Hitzeschockpromotor, um die Produktion von FLP zu induzieren, während ein FRT-flankierter Vektor den CaMV 35S-Promotor vom beta-Glucuronidase-Gen (GUS) trennte. Als die Pflanzen einem Hitzeschock ausgesetzt wurden, führte die FLP-Induktion zur Exzision des FRT-flankierten Vektors, wodurch das GUS-Gen direkt stromabwärts des CaMV 35S-Promotors verschoben wurde. Die Aktivierung von GUS führte dazu, dass sich die Blätter der Pflanzen von grün nach blau verfärbten; somit meldete der Phytosensor dem Modellsystem effektiv Stress!
Mit Cre-RekombinaseEdit
Herstellung des gate-way-ready induzierbaren MiRNA (GRIM)-ExpressionssystemsEdit
RNA-Interferenz (RNAi) hat einen Paradigmenwechsel in der Expression von Genen und potenziellen Gen-Knockouts in Eukaryoten bewirkt. Vor der Herstellung des GRIM-Expressionssystems war die Herstellung von RNAi-Vektoren teuer und zeitaufwendig. Die Vektoren wurden mit der traditionellen Methode des Kopierens und Einfügens von Molekülklonen hergestellt. Garwick-Coppens et al. (2011) entwickelten eine wesentlich effizientere Methode zur Herstellung von RNAi-Vektoren, bei der die RNAi-Expression mit Cre-Rekombinase ein- und mit Flp-Rekombinase ausgeknockt werden kann. Mit dem neuartigen GRIM-Expressionssystem lassen sich Expressionsvektoren, die künstliche RNAi-Konstrukte enthalten, wesentlich schneller herstellen. Die Autoren zeigten weiter, dass ihr Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK), einer in der Molekularforschung häufig verwendeten menschlichen immortalisierten Zelllinie, recht effektiv funktioniert.