FFPE-Proben – Aufbereitung menschlicher Gewebeproben – Lab-Ally

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Einführung |Gewebebeschaffung |FFPE-Gewebeaufbereitung |Schneiden | Referenzen

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Einführung

Viele Forscher ziehen es heute vor, FFPE-Gewebeproben für ihre IHC-, histologischen oder in-situ-Genomanalysen zu verwenden. FFPE steht für „Formalin-Fixed Paraffin-Embedded“ und beschreibt die beiden Hauptmerkmale dieser Methode der Gewebekonservierung. Formalin ist eine Formaldehydlösung und wird seit der Entdeckung der konservierenden Wirkung von Formaldehyd durch den deutschen Arzt Ferdinand Blum in den späten 1800er Jahren verwendet (Fox, et al., 1985). Nach der Fixierung mit Formaldehyd wird Paraffin in das Gewebe infundiert und das Gewebe mit einer Paraffinhülle umgeben, um es zu stützen und vor Oxidation zu schützen. Professionell fixierte und eingebettete FFPE-Proben und die darin enthaltenen Biomoleküle sind bei Umgebungstemperaturen einigermaßen stabil. Strukturell sind die fixierten und eingebetteten Gewebe widerstandsfähig und können fast unbegrenzt für mikroskopische Anatomiestudien verwendet werden, aber im Laufe der Zeit baut sich die Antigenität einiger Proteine ab, so dass IHC-Studien nur an Proben durchgeführt werden können, die nicht älter als ein paar Jahrzehnte sind. Doppelstrang-DNA ist in FFPE-Blöcken erstaunlich stabil, aber andere, weniger stabile Biomoleküle wie RNA können sich innerhalb eines Jahrzehnts oder weniger abbauen, vor allem, wenn Schnitte gemacht wurden.

Archive, in denen eine große Anzahl von FFPE-Proben gesammelt wird, sind eine besonders ergiebige Datenquelle, wenn ein Vergleich vieler Fälle (d. h. FFPE-Proben von mehreren Spendern) erwünscht ist, um statistisch zuverlässige Schlussfolgerungen über die Merkmale bestimmter Indikationen zu ziehen. Wenn die FFPE-Proben in der biomedizinischen Forschung mit „hohem Einsatz“ verwendet werden sollen, ist es wichtig, dass jeder Schritt des Aufbereitungsprozesses von vollständig ausgebildeten und zertifizierten Fachleuten durchgeführt wird, vorzugsweise in einem CLIA-zertifizierten (d. h. staatlich kontrollierten) oder CAP-akkreditierten (College of American Pathologists) Labor.

Es ist zu beachten, dass das FFPE-Verfahren nicht allgemein standardisiert ist und dass Einrichtungen auf der ganzen Welt leicht abweichende Protokolle mit unterschiedlichen Formalinlösungen verwenden oder das Verfahren anderweitig an ihre Präferenzen und Anforderungen anpassen können. Im Folgenden finden Sie einen Überblick über den Prozess und eine Beschreibung der einzelnen Schritte sowie einige gängige Variationen.

Gewebebeschaffung

Vor der Gewebeverarbeitung steht der notwendige Schritt der Gewebebeschaffung. Dies ist eigentlich das am schwierigsten zu kontrollierende Element, da es mit der Patientenversorgung, der Einhaltung von 41CFR46 und in den USA mit der Aufsicht des internen Prüfungsausschusses (IRB) verbunden ist. Die Besonderheiten des medizinischen Verfahrens und die Konventionen der Standardversorgung sind wichtig, weil sie sich auf Variablen wie die Zeitintervalle zwischen der Verabreichung der Anästhesie und der Abbindung der Gefäße, die Entnahme des Gewebes und die verstrichene Zeit vor der Fixierung auswirken können, von denen jede die Qualität der Probe beeinflussen kann. So ist es beispielsweise wahrscheinlich, dass während des Zeitintervalls zwischen der Unterbindung der Blutzufuhr und der Gewebeentnahme, der so genannten warmen Ischämiezeit, Veränderungen der RNA und der Proteine auftreten (Dash et al., 2002). Diese Ischämiezeit kann von Minuten bis zu Stunden reichen, je nach Organ, den Standardarbeitsanweisungen der Einrichtung, dem Chirurgen und anderem beteiligten medizinischen Personal sowie dem chirurgischen Ansatz. Aus diesem Grund wird empfohlen, diese Zeit für jede Probe aufzuzeichnen und auf ein Minimum zu beschränken (Hewitt, et al., 2008).

FFPE-Gewebeverarbeitung

Nach der Entnahme der Gewebeprobe kann eine zusätzliche Triage, Dissektion oder Mikrodissektion (zusammenfassend als Grossing bezeichnet) erforderlich sein, um den spezifischen Teil des Gewebes zu isolieren und vorzubereiten, der die weiteren Verarbeitungsschritte durchläuft. Die Gewebeverarbeitung ist heute oft vollständig automatisiert, bis auf den letzten Schritt, das Einbetten, das manuell durchgeführt werden kann. Es gibt eine Vielzahl von Gewebeverarbeitungsgeräten, die jedoch alle die oben dargestellte Abfolge der ersten vier Schritte befolgen. Die Automatisierung der verschiedenen Schritte trägt dazu bei, Variationen im Verfahren als Ursache für unterschiedliche Versuchsergebnisse zwischen verschiedenen FFPE-Proben auszuschließen.

Fixierung

Die Fixierung ist der erste Schritt der FFPE-Gewebeverarbeitung. Zu den kritischen Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt, gehören die zu verwendende Lösung, die Dauer der Fixierung sowie die Dicke und die histologischen Eigenschaften der zu fixierenden Gewebeprobe.

– Lösung

Das von den meisten Labors verwendete Fixiermittel ist neutral gepuffertes 10%iges Formalin. Formalin ist eine Flüssigkeit, die aus 37-40% Formaldehyd und 10% Methanol (nach Gewicht) in Wasser besteht; eine 10%ige Formalinlösung enthält also etwa 3,7% – 4% Formaldehyd und 1% Methanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). In Wirklichkeit liegt Formaldehyd in Lösung vor allem als Monomere oder kleine Polymere von Methylenglykol (Methandiol, Formaldehydmonohydrat) vor, das durch die reversible Reaktion von Formaldehyd mit Wasser gebildet wird. Methylenglykol-Polymere mit hohem Gewicht werden als Paraformaldehyd bezeichnet und fallen aus der Lösung aus, aber Methanol verlangsamt diesen Polymerisationsprozess, weshalb es in Formalinlösungen enthalten ist. Mit Wasser verdünntes Formalin (z. B. 10 % Formalin) – insbesondere wenn es sich um eine Pufferlösung handelt – enthält hauptsächlich Monomere, da die große Anzahl von Wassermolekülen die Methylenglykolpolymere aufbricht, die normalerweise in einer Lösung mit höherer Formaldehydkonzentration vorhanden wären (Kiernan, 2000). Puffer, der verbleibende Bestandteil von Formalin, werden ebenfalls hinzugefügt, da Formaldehyd dazu neigt, zu Ameisensäure zu oxidieren (Fox, et al., 1985). Ameisensäure kann bei der Fixierung von Gewebe zur Ausfällung von Formalinpigmenten (saures Hämatin) führen, die den von einigen Parasiten produzierten Pigmenten ähneln können (Pizzolato, 1976). Die Pufferung von Formalin verhindert dies. Zu den gängigen Puffermitteln gehören Magnesiumcarbonat, Calciumcarbonat, Citrat, Tris und Phosphatpuffer (Hewitt, et. al., 2008). Handelsübliches Formalin enthält häufig Phosphatpuffer. „Neutral gepuffert“, wie Formalin in der Regel hergestellt wird, bedeutet einfach, dass der pH-Wert bei etwa 7 gehalten wird.

– Prozess und Mechanismus

Aufgrund des geringen Molekulargewichts von Formaldehyd und Methylenglykol dringt Formalin (hauptsächlich Methylenglykol in Lösung) relativ schnell in das Gewebe ein, und zwar mit einer Geschwindigkeit, die vom Gewebetyp abhängt, aber im Durchschnitt bei 1 mm/Stunde liegt (Hewitt, et al., 2008). Die Protokolle für die Fixierung variieren daher je nach Art des zu fixierenden Gewebes. Im Gewebe angekommen, beginnt der Anteil der in Lösung befindlichen Formaldehydmoleküle, sich mit den Proteinen zu vernetzen, was jedoch viel langsamer geschieht als die Diffusionsgeschwindigkeit. Durch die Reaktion des Formaldehyds mit dem Gewebe wird es aus der Lösung herausgezogen und die reversible Reaktion von Formaldehyd zu Methylenglykol zurück in Richtung Formaldehyd gezogen, so dass mehr Formaldehyd produziert wird, obwohl es verbraucht wird (Fox, et al., 1985). Lysin-Aminoseitenketten sind die reaktionsfreudigsten mit Formaldehyd, aber auch Arginin, Asparagin, Histidin, Glutamin, Serin und Tyrosin sind in gewissem Maße mit Formaldehyd reaktionsfreudig (Howat und Wilson, 2014). Nach der Reaktion kann die resultierende Hydroxymethylgruppe, die an den Komplex gebunden ist, weiter mit demselben Protein oder anderen Proteinen reagieren und so stabile Methylenbrücken (Protein-CH2-Protein) bilden (Kiernan, 2000). Dies ist der Grund für die Unlöslichkeit und Steifheit von Geweben, die mit Formalin fixiert und damit konserviert wurden. Etwa 24-48 Stunden sind erforderlich, damit diese Vernetzung im gesamten Gewebe ausreichend stattfindet (Thavarajah, et al., 2012), aber es wurde empfohlen, nicht mehr als 36 Stunden für diesen Prozess zuzulassen, da eine Fixierung über einen längeren Zeitraum die Qualität der Biomoleküle in den FFPE-Proben beeinträchtigt, beispielsweise durch Verkürzung der Länge der Nukleinsäuren, die extrahiert werden können (Hewitt, et al., 2008).

– Einschränkungen

Der Hauptvorteil der Verwendung von Formaldehyd – insbesondere in Form von neutral gepuffertem 10 %igem Formalin – besteht darin, dass es eine Vielzahl von Geweben und Komponenten konserviert. Es gibt jedoch auch Einschränkungen. So wird für die Elektronenmikroskopie in der Regel eine Kombination aus Formaldehyd und Glutaraldehyd (C5H8O2) oder eine Lösung aus Glutaraldehyd allein verwendet (Kiernan, 2000), da diese Lösungen die Gewebestrukturen für diesen Zweck besser konservieren können. Beachten Sie, dass Gewebe, das mit einer Glutaraldehyd- oder Glutaraldehyd-Aldehyd-Lösung präpariert wurde, nicht als FFPE-Proben gelten. Eine weitere Herausforderung ist die Gewinnung von DNA- und RNA-Molekülen aus FFPE-Gewebe, da Formalin dazu neigt, Nukleinsäuren zu verändern – bis hin zur Einführung künstlicher Mutationen in der DNA – und sie in kleine Fragmente zu zerlegen (Srinivasan, Sedmak und Jewell, 2002). Dennoch ist es möglich, DNA- und RNA-Fragmente aus FFPE-Gewebe zu extrahieren, die für die Analyse geeignet sind, wie in einem Protokoll von Tang et al. (2009) beschrieben, wobei ein Schlüsselfaktor für die Nukleinsäuregewinnung ein geeigneter Protease-Verdau ist. Kommerzielle Kits für die Nukleinsäureextraktion aus FFPE-Proben sind ebenfalls erhältlich.

– Probendicke

Ein weiterer wichtiger Punkt, der bei der Formalinfixierung zu beachten ist, ist die Dicke der Gewebeprobe. Zwar durchdringt Formalin das Gewebe, wie bereits erwähnt, relativ schnell, doch hat die Dicke des Gewebes Auswirkungen auf die Qualität der fixierten Probe. Es dauert länger, bis das Formalin das Zentrum dickerer Gewebeproben erreicht. Während das Formalin allmählich in das Innere der Probe diffundiert, hat in den äußeren Regionen der Prozess der Fixierung bereits begonnen, so dass die Biomoleküle dort mit größerer Wahrscheinlichkeit in der für die vollständige Fixierung erforderlichen langen Zeit abgebaut werden. Außerdem besteht bei Einhaltung von Zeitlimits (wie z. B. maximal 36 Stunden, wie oben erwähnt) die Möglichkeit, dass die Gewebeprobe nicht in ihrer Gesamtheit ausreichend fixiert (konserviert) wird. Aus diesem Grund sollten Gewebe für die Fixierung, die breiter als einige Millimeter oder vielleicht ein oder zwei Zentimeter sind, für eine optimale Fixierung besser in dünnere Segmente zerlegt werden (Hewitt, et al., 2008). Institutionen können unterschiedliche Protokolle für die Zeitdauer und das Volumen des Fixiermittels haben, die für Gewebeproben unterschiedlicher Breite erforderlich sind, aber im Allgemeinen sollte das Verhältnis zwischen dem Volumen des Fixiermittels und dem Volumen des Gewebes 10:1 betragen (Klatt, 2016).

Dehydratisierung

Der zweite Schritt bei der Verarbeitung von FFPE-Proben ist die Dehydratisierung. Da Paraffin mit Wasser nicht mischbar ist, muss das gesamte Wasser aus der Formalinlösung aus dem Gewebe entfernt werden, bevor das Paraffin in das Gewebe eindringen kann. Eine Reihe von Alkohollösungen (häufig Ethanol), häufig beginnend mit 70 % und aufsteigend auf 100 % Alkohol, wird verwendet, um dem Gewebe im Wesentlichen das gesamte Wasser zu entziehen. Für eine optimale Dehydratisierung ist es erforderlich, frische Lösungen zu verwenden oder die verwendeten Lösungen häufig zu ersetzen, da der Alkohol mit der Zeit immer mehr verdünnt wird. Außerdem muss dieser Schritt unbedingt vollständig durchgeführt werden (und es muss ausreichend Zeit für diesen Schritt eingeplant werden), da eine unzureichende Dehydratisierung zu einem Abbau des Gewebes führen kann (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Clearing

Da Paraffin auch mit Alkoholen nicht mischbar ist, muss im nächsten Schritt der Alkohol mit einer Substanz entfernt werden, die mit Paraffin mischbar ist. Dieser Schritt wird als Klärung bezeichnet, und Xylol ist das am häufigsten verwendete Klärungsmittel (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Paraffininfiltration

Nach einer angemessenen Fixierung, Dehydrierung und Klärung kann das Gewebe schließlich einer Paraffininfiltration (oder Imprägnierung) unterzogen werden. Auch dieser Schritt ist nicht standardisiert, und Einrichtungen auf der ganzen Welt können unterschiedliche Paraffine und Wachsmischungen mit unterschiedlicher Zusammensetzung verwenden. Paraffine haben unterschiedliche Schmelzpunkte und Texturen, die sich auf den endgültigen Gewebeblock und seine Eigenschaften auswirken. In den Vereinigten Staaten und in Westeuropa werden normalerweise synthetische Paraffine mit niedrigem Schmelzpunkt (55°C-63°C) verwendet, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Latex, Dimethylsulfoxid und firmeneigene „Weichmacher“ können in die Formulierung aufgenommen werden, um die Textur und Formbarkeit der endgültigen Gewebeprobe zu verändern (Hewitt, et al., 2008).

Nationen aus anderen Teilen der Welt mischen ihren Formulierungen häufig Bienenwachs bei, um die Formbarkeit zu verbessern und die Schmelztemperatur der verwendeten Paraffine niedriger Qualität zu senken. Bienenwachs enthält jedoch Verunreinigungen wie Pollen und mindert die Qualität der Endprobe. Höhere Schmelztemperaturen sind zu vermeiden, da sie später zu einer verminderten und unzureichenden Entparaffinierung der Gewebeprobe sowie zu einer Verringerung der aus dem Gewebe gewonnenen Nukleinsäuremenge führen (Hewitt, et al., 2008).

Paraffineinbettung

Der letzte Schritt bei der Verarbeitung von FFPE-Proben ist die Paraffineinbettung. Die mit Paraffin infiltrierte Gewebeprobe wird mit einer Paraffinschicht umgeben. Es muss darauf geachtet werden, dass der Gewebeblock in der Form („Kassette“) korrekt ausgerichtet ist, da dies Auswirkungen auf die Schnittebene hat, wenn mit einem Mikrotom Dünnschnitte vom Block geschnitten werden (Klatt, 2016). Sobald sich die Paraffinhülle verfestigt hat, ist der FFPE-Block lagerfähig und bleibt jahrelang, ja sogar bis zu Jahrzehnten, gut erhalten (Hewitt, et al., 2008).

Schneiden

Wenn das Gewebe eingebettet ist, ist es bereit für das Schneiden mit dem Mikrotom. Da das Gewebe nicht immer ganz flach an der Vorderseite des Paraffins anliegt, muss der Histotechnologe in der Regel in den Block „hineinschauen“. Der Gewebeblock wird in den Blockhalter des Mikrotoms eingesetzt, und während der Histotechnologe den Winkel des Blockhalters so einstellt, dass so wenig Gewebe wie möglich verloren geht, dreht er das Handrad und bewegt den Block gegen eine scharfe Klinge auf und ab. Der Block wird so lange geschnitten, bis sich ein vollständiger repräsentativer Abschnitt des Gewebes an der Vorderseite des Blocks befindet. Sobald das Gewebe zu sehen ist, wird der Block zum Abkühlen auf Eis gelegt, was das Schneiden von Dünnschnitten erleichtert; zu warmes Paraffin führt zu komprimiertem Gewebe mit faltigen Schnitten. Wenn der Block abgekühlt ist, wird er wieder in den Blockhalter gelegt. Der Techniker dreht erneut das Handrad, diesmal in einem langsamen, gleichmäßigen Tempo, um aufeinanderfolgende dünne Schnitte zu erzeugen, die aneinander haften und ein „Band“ bilden.“ Das Band wird in ein warmes Wasserbad gelegt (die Temperatur wird knapp unter dem Schmelzpunkt des Paraffins gehalten), um eventuell entstandene Falten zu glätten. Der Techniker legt dann einen Objektträger in das Wasserbad und „schöpft“ den/die ausgewählten Abschnitt(e), so dass sie am Objektträger haften bleiben.

Die gängigste Dicke für Gewebeschnitte liegt bei 3-5 Mikrometern (oder kurz Mikron), was der Dicke einer einzelnen Zelle entspricht. Objektträger mit Schnitten von 3-5 Mikrometern werden in der Regel für Färbungen verwendet, sei es die Standardfärbung mit Hämatoxylin & Eosin (H&E), eine spezielle Färbung oder eine immunhistochemische Färbung (IHC). Forscher verlangen häufig „Curls“ anstelle von Dünnschnitten auf Objektträgern. Curls sind dickere Schnitte (10 Mikrometer oder mehr), die in Eppendorf-Röhrchen gegeben werden und in der Regel verwendet werden, wenn RNA oder DNA aus den FFPE-Proben extrahiert werden soll. Dickere Schnitte können auch auf Objektträger statt auf Röhrchen gelegt werden; dies ist optimal, wenn nur ein Teil des Gewebes für die Extraktion verwendet wird. In diesem Fall wird das Gewebe vom Objektträger abgeschabt und in ein Röhrchen gegeben. FFPE-Proben, die geschnitten wurden, sind strukturell stabil und können bei ordnungsgemäßer Behandlung und Lagerung noch einige Zeit nach dem Schneiden für mikroskopische Analysen verwendet werden. Wenn jedoch chemische Extraktionen durchgeführt werden sollen, sollten die Schnitte im Allgemeinen so bald wie möglich nach dem Schneiden verwendet werden, um einen oxidativen und biologischen Abbau der freiliegenden Zielmoleküle zu verhindern.

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