Die Funktion von Chaperonproteinen in der Assemblage von Proteinkomplexen, die an den Adhäsions- und Fusionsprozessen der Gameten beteiligt sind

Multiproteinkomplexe in der Spermienkapazitation und ZP-Interaktion

Beim Erreichen des Befruchtungsortes, der Ampulla, müssen die Spermien zwei Barrieren durchdringen, bevor sie mit der Plasmamembran der Eizelle, dem Oolemma, verschmelzen. Die erste dieser Barrieren ist eine hyaluronsäurereiche Schicht von Kumuluszellen, die die Eizelle umgeben, und die zweite ist die extrazelluläre Matrix der Eizelle selbst, die ZP (Hartmann et al. 1972). Obwohl sich während der Spermatogenese sowohl ZP- als auch Hyaluronsäure-Bindungsstellen entwickeln und die Spermatozoen beim Durchgang durch die Nebenhoden ein Bindungspotenzial erwerben, benötigen diese Zellen eine bestimmte Aufenthaltsdauer im weiblichen Fortpflanzungstrakt, bevor sie erfolgreich an solchen Interaktionen teilnehmen können (Austin 1951, Chang 1951). Die kollektiven Veränderungen, die die Spermien in dieser Umgebung durchlaufen, werden als Kapazitation bezeichnet und ermöglichen es den Zellen, auf Signale aus dem Kumulus-Oozyten-Komplex zu reagieren und einen Prozess der akrosomalen Exozytose abzuschließen, der sie für die Verschmelzung mit dem Oolemma befähigt.

Das ZP besteht aus einer Reihe von Sulfoglykoproteinen, nämlich ZP1, ZP2 und ZP3, die in den meisten Säugetierarten hoch konserviert sind (obwohl ein zusätzlicher Ligand, ZP4/B, in menschlichen und Schweineozyten berichtet wurde) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Es wird allgemein angenommen, dass diese Liganden die Spermienbindung bei den meisten Arten steuern (siehe auch Reid et al. (2011)). Bemerkenswerterweise werden jedoch derzeit noch verschiedene Modelle in Bezug auf die Identität des primären Spermienrezeptors innerhalb der ZP und die Mechanismen, durch die Spermatozoen an dieser Matrix haften, erwogen (siehe auch Visconti & Florman (2010)). Auch Untersuchungen zur Identität der entsprechenden Spermienoberflächenrezeptoren, die den/die entsprechenden Liganden auf dem ZP erkennen, haben keine endgültigen Antworten geliefert. In der Tat gibt es eine wachsende Anzahl von Knockouts bei Mäusen von vielversprechenden Rezeptorprotein-Kandidaten (einschließlich β-1,4-Galaktosyltransferase (GALT1), Arylsulfatase A (ARSA) und Spermienadhäsionsmolekül 1 (SPAM1); für eine vollständige Liste siehe Ikawa et al. (2010)), die alle nicht zu vollständiger Unfruchtbarkeit führen (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Vielmehr werden verschiedene Grade einer reduzierten Bindungsfähigkeit gezeigt, was die Möglichkeit aufwirft, dass dieser Prozess ein gewisses Maß an funktioneller Redundanz umfasst und dass eine Reihe von Spermaproteinen bei der Vermittlung der ZP-Adhäsion zusammenwirken. Die Koordinierung der Aktivität dieser Proteine zur Gewährleistung produktiver ZP-Interaktionen wird daher zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt.

Bei den meisten eutherischen Säugetieren wird angenommen, dass die Spermienkapazitation durch die Aktivierung eines cAMP-vermittelten Weges eingeleitet wird, der in der Tyrosinphosphorylierung mehrerer Spermaproteine gipfelt (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Molekulare Chaperone spielen in dieser Reihe von Proteinen eine herausragende Rolle, wobei HSP90AA1, HSP90B1 und HSPD1 zu den Proteinen gehören, bei denen eine Tyrosinphosphorylierung als Folge der Kapazitation festgestellt wurde (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). Aktuelle Modelle deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung dieser Chaperone während der Kapazitation ihre aktive Rolle bei der Zusammenstellung von ZP-Erkennungsproteinen zu Komplexen und/oder der Verlagerung dieser Komplexe an die Oberfläche der Spermatozoen zur Vorbereitung der Befruchtung auslöst (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Neben dieser indirekten Rolle bei der Adhäsion der Gametenzellen haben die Spermienoberflächen-Chaperone auch eine angebliche Funktion als Adhäsionsmoleküle, die die Erkennung von Sulfoglykolipiden während der Gametenzellenbindung vermitteln (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

In jüngster Zeit wurde die Technik der blauen nativen PAGE (BN-PAGE), die ursprünglich für die Analyse von Multienzymkomplexen der Elektronentransportkette entwickelt wurde (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), für die Bewertung multimerer Spermienoberflächenkomplexe bei Mäusen und Menschen angepasst (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Diese Technik ermöglicht die elektrophoretische Auflösung von nativen Proteinkomplexen, die ihre biologische Aktivität beibehalten. In menschlichen und Mäusespermatozoen hat die Verwendung von BN-PAGE parallel zu Far-Western-Blotting mit ganzen solubilisierten Zonae mehrere primäre Multiproteinkomplexe aufgedeckt, die eine Affinität für homologe ZP besitzen (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Einer dieser Komplexe soll aus den Proteinkomponenten des CCT/TRiC-Komplexes (CCT1-CCT8) bestehen, einer Doppelringstruktur, die als molekulares Chaperon fungiert und eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Bildung von Multiproteinkomplexen spielt (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Mutmaßliche Beweise in Form von Co-Immunopräzipitations-, Co-Lokalisierungs- und Proximity-Ligations-Assays haben das ZP-bindende Protein 2 (ZPBP2) als eines der überzeugendsten Kundenproteine für den CCT/TRiC-Komplex in reifen Spermien identifiziert (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Ursprünglich wurde es mit der sekundären ZP-Bindung in Verbindung gebracht, doch eine neuere Studie hat gezeigt, dass männliche Mäuse, bei denen kein ZPBP2 vorhanden ist, unfruchtbar sind und Defekte bei der ZP-Interaktion und Penetration aufweisen (Lin et al. 2007). Bei Mäusen gibt es zusätzliche Hinweise darauf, dass bestimmte Untereinheiten des CCT/TRiC-Komplexes während der Spermienkapazitation auf die Spermienoberfläche verlagert werden (Dun et al. 2011).

Eine weitere prominente Klasse von Chaperonen, die auf der Spermienoberfläche identifiziert und in die Regulierung von ZP-Interaktionen einbezogen wurde, ist die HSP70-Familie (Naaby-Hansen et al. 2010). Wie der CCT/TRiC-Komplex haben auch die Chaperone der HSP70-Familie eine gut dokumentierte Rolle bei der Erleichterung des Transmembranproteintransports und der Bildung stabiler Proteinkomplexe (Mayer & Bukau 2005). Ein Mitglied der HSP70-Familie, das ausschließlich (Maus) oder überwiegend (Mensch) in den Hoden exprimiert wird, scheint für die männliche Fruchtbarkeit wesentlich zu sein. Tatsächlich wurde eine abweichende Expression dieses Chaperons, HSPA2, beim Menschen mit einem Phänotyp schwerer männlicher Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht, der insbesondere die Fähigkeit der Spermatozoen beeinträchtigt, in vitro mit homologen Eizellen zu interagieren (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen spielt HSPA2 eine grundlegende Rolle bei der Spermatogenese, wobei die gezielte Deletion des Proteins bei der erstgenannten Spezies zu einem frühen Stillstand dieses Prozesses und dem gleichzeitigen Fehlen von Spermien führt (Eddy 1999). Beim Menschen wurde die Expressionshöhe von HSPA2 positiv mit dem Erfolg der Befruchtung in vitro korreliert (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) und ist daher angeblich in der Lage, den Fruchtbarkeitsstatus von Männern mit einem hohen Grad an Genauigkeit vorherzusagen (Ergur et al. 2002).

Die Charakterisierung von HSPA2 in unserem eigenen Labor hat ergeben, dass dieses Chaperon in der akrosomalen Domäne menschlicher Spermien vorkommt und Bestandteil von mindestens fünf Proteinkomplexen mit hoher Molekülmasse ist (Redgrove et al. 2012), darunter eine Untergruppe derjenigen, die nachweislich eine ZP-Affinität besitzen (Redgrove et al. 2011). In Übereinstimmung mit diesen Daten haben wir Beweise dafür gesichert, dass der dominanteste der HSPA2-Komplexe zwei zusätzliche Proteine enthält, die beide bereits früher in die Spermien-Zona-Interaktionen einbezogen wurden (Redgrove et al. 2012). Darüber hinaus konnten wir in Übereinstimmung mit den veröffentlichten Ergebnissen von Huszar et al. eine signifikante Verringerung der HSPA2-Spiegel in den Spermien von Männern mit isolierten Läsionen nachweisen, was ihre Fähigkeit zu Interaktionen mit ZP homologer Eizellen in vitro beeinträchtigt (Redgrove et al. 2012). Unsere derzeitige Arbeit konzentriert sich auf die Frage, ob das Defizit bei der ZP-Adhäsion entweder aus einer abnormen Bildung von ZP-Bindungsstellen in den frühen Stadien der Spermiogenese resultiert (Huszar et al. 2000) oder das Ergebnis der Unfähigkeit von HSPA2 ist, sich an der Umgestaltung der Spermienoberfläche während der Kapazitation zu beteiligen, wie z. B. die Erleichterung des Aufbaus und/oder der Präsentation von ZP-Rezeptoren auf der Spermienoberfläche in Vorbereitung auf die ZP-Interaktion.

Zusätzlich zu unserer eigenen Arbeit über den Aufbau von Spermienoberflächenkomplexen haben Han et al. unabhängig voneinander einen alternativen, mit Chaperonen beladenen Multiproteinkomplex auf der Oberfläche von Mäusespermatozoen identifiziert. Interessanterweise wird dieser Komplex, der aus HSPA5, Calnexin, dem integralen Membranprotein 2B und ADAM7 besteht, wie oben dokumentiert, offenbar während der Kapazitation aufgebaut (Han et al. 2011). Während die Funktion dieses Komplexes noch nicht vollständig geklärt ist, wurde die Expression von ADAM7 mit dem Vorhandensein weiterer ADAM-Proteine, ADAM2 und ADAM3, in Verbindung gebracht (Kim et al. 2006), die für die Adhäsion von Spermien an der ZP wichtig sind (Muro & Okabe 2011). Darüber hinaus ist bekannt, dass HSPA5 an der Förderung der Adhäsion hochwertiger Spermien an den Epithelzellen des Ovidukts (OEC) im Isthmus des weiblichen Fortpflanzungstrakts beteiligt ist. Es wird angenommen, dass die Bildung dieses Reservoirs überlebensfördernde Auswirkungen hat, indem es die Spermien in einem nicht-kapazitierten, ruhenden Zustand hält, um sie auf die Freisetzung der Eizelle in die Ampulle vorzubereiten (Topfer-Petersen et al. 2002). Interessanterweise wurden die Chaperone HSPD1 und HSPA5 auch auf der Oberfläche von Rinder-OEC lokalisiert und sind somit an der Bindung zwischen Spermien und OEC beteiligt (Boilard et al. 2004).

In Übereinstimmung mit unserer eigenen Arbeit wurde der von Han et al. Es konnte gezeigt werden, dass sich der von Han et al. identifizierte Komplex in Membranmikrodomänen oder Lipid Rafts befindet, spezialisierten Regionen der Membran, die eine Plattform für den funktionellen Aufbau und die Präsentation von Multiproteinkomplexen bieten (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Die Verteilung von Chaperonkomplexen in der Raft-Umgebung wurde auch für HSPA2 in menschlichen Spermien (Nixon et al. 2011) und für Komponenten des CCT/TRiC-Komplexes in Mäusespermien (Dun et al. 2011) beobachtet. Diese Membrandomänen umfassen auch eine Reihe weiterer mutmaßlicher ZP-Rezeptorproteine, darunter GALT1, ZP3R und SPAM1, was ihre Rolle bei der Umgestaltung der Spermienoberfläche und bei der ZP-Bindung unterstreicht (Abb. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Die Mechanismen, durch die solche Proteine in die Lipid Rafts rekrutiert werden, sind noch nicht geklärt; es wurde jedoch berichtet, dass HSPA2 über seine ATPase-Domäne an 3′sulfogalactosylglycerolipid bindet, das wichtigste Glykoprotein, das in den Lipid Rafts von Spermien identifiziert wurde (Mamelak & Lingwood 2001).

Zusätzlich zu der vermuteten Rolle der Lipid Rafts bei der Neupositionierung von wichtigen Chaperonkomplexen und ZP-Rezeptorproteinen gibt es auch überzeugende Beweise dafür, dass viele mutmaßliche ZP-Rezeptoren, wie ARSA und ZP3R, sowie mehrere molekulare Chaperone eine kapazitationsabhängige Verlagerung von intrazellulären Stellen wie dem Akrosom zur Spermienoberfläche zeigen, um die Zellen vor ihrer Interaktion mit dem ZP vorzubereiten (Nixon et al. 2009). Es wurde vorgeschlagen, dass der enge Kontakt zwischen der äußeren Akrosomenmembran und der Plasmamembran der Spermien durch die Bindung komplementärer löslicher N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-Attachment-Protein-Rezeptor (SNARE)-Proteine vermittelt wird, was zur Bildung von Fusionsporen führt, die einen Weg für die Migration von Enzymen zur Spermienoberfläche vor dem vollständigen Verlust des Akrosomeninhalts bieten (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). Zur Unterstützung dieses Modells wurde in einer Studie von Brahmaraju et al. (2004) nachgewiesen, dass die Verabreichung von Antikörpern gegen VAMP und SNAP in das akrosomale Vesikel die Spermien-ZP-Bindung in der Maus hemmte.

Dieses fortschreitende Priming der Spermienoberfläche hat Fragen hinsichtlich der Alles-oder-Nichts-Natur der akrosomalen Exozytose aufgeworfen. Nichtsdestotrotz scheint der funktionelle Aufbau von SNARE-Komplexen auch die verlängerten Spermienmembran-Fusionsereignisse zu unterstützen, die einen vollständigen Verlust des akrosomalen Inhalts ermöglichen (Tsai et al. 2010). Obwohl weithin davon ausgegangen wird, dass der Kontakt mit dem ZP diese akrosomale Exozytose bei den meisten Säugetierarten auslöst, haben eine Reihe von Studien an der Maus gezeigt, dass Spermien, die vor dem Kontakt mit dem ZP mit der akrosomalen Exozytose beginnen, die Eizelle dennoch befruchten können (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Dieses Phänomen kann auch auf Meerschweinchen- (Huang et al. 1981) und Hamsterspermatozoen (Yanagimachi & Phillips 1984) zutreffen. Diese Befunde deuten auf eine wichtige Rolle des Cumulus oophorus bei der Auslösung der Akrosomreaktion hin und geben Anlass zu Bedenken hinsichtlich der Fähigkeit von In-vitro-Studien, die mit kumulus-entblößten Zona-Strukturen der Eizelle durchgeführt werden, die wahre Natur der Akrosomreaktion und der ZP-Interaktion genau zu beschreiben.

Ungeachtet dieser Kontroverse wurden chaperonähnliche Moleküle auch mit der akrosomalen Exozytose in Verbindung gebracht, und zwar aufgrund ihrer Fähigkeit, den Zusammenschluss von glutaminhaltigen SNAREs (Q-SNAREs) und argininhaltigen SNARES (T-SNAREs) zu engen ternären Komplexen zu fördern (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Interessanterweise haben elegante Studien an Schweinen gezeigt, dass die Kapazitation ein stabiles Andocken der Plasmamembran der Spermien an die äußere akrosomale Membran in Vorbereitung auf die Befruchtung bewirkt (Tsai et al. 2010). Neuere Studien von Tsai et al. (2012) haben auch das Vorhandensein von unilamellaren gemischten Vesikeln nachgewiesen, die neben anderen wichtigen Funktionen die Rekrutierung von sekundären ZP-Bindungsproteinen an der Spermienoberfläche ermöglichen und einen neuartigen trimeren SNARE-Komplex besitzen, der aus Syntaxin 3, SNAP23, VAMP2 und einem weiteren Protein, Complexin 2, besteht. Die durch die Bildung solcher Komplexe freigesetzte Energie wird wiederum genutzt, um die Membranfusion einzuleiten, indem die Plasmamembran und die innere akrosomale Membran des Spermiums zusammengezogen werden (Tomes et al. 2002). Der Abschluss dieses Prozesses ist entscheidend für die Freilegung der Spermienbereiche, die an den nachgeschalteten Ereignissen der Befruchtung beteiligt sind: Bindung des Oolemmas und Fusion.