Deoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) sind die wesentlichen Bausteine von Nukleinsäuremolekülen und als solche notwendige Bestandteile von PCR-Mischungen, da ohne sie keine neue (amplifizierte) DNA erzeugt werden kann. Die vier einzelnen Desoxynukleotide, aus denen eine DNA-Sequenz besteht (d. h. Desoxyadenosintriphosphat, dATP; Desoxythymidintriphosphat, dTTP; Desoxycytosintriphosphat, dCTP; und Desoxyguanosintriphosphat, dGTP) werden den PCR- und RT-PCR-Mischungen in der Regel in äquimolaren Mengen zugesetzt. Besteht die durch PCR zu amplifizierende Ziel-DNA-Sequenz jedoch hauptsächlich aus dATP/dTTP (AT-Verhältnis) oder hauptsächlich aus dGTP/dCTP (GC-Verhältnis), so kann das molare Verhältnis der der PCR-Mischung zugesetzten dNTPs geändert werden, um dieses Ungleichgewicht zu berücksichtigen. dNTPs werden in der Regel entweder einzeln oder als (äquimolare) Mischung von kommerziellen Anbietern (z. B. Roche, Promega usw.) gekauft und sind chemisch stabil, wenn sie in leicht alkalischen wässrigen Lösungen bei -20 °C gelagert werden. Es ist jedoch zu beachten, dass dNTPs in Lösung von Natur aus sauer sind; daher müssen Arbeits- und Stammlösungen vor der Langzeitlagerung möglicherweise mit alkalischen Verbindungen neutralisiert werden. Neutralisierte dNTP-Lösungen werden in der Regel durch Spektralphotometrie oder durch Zugabe des richtigen Volumens an sterilem Wasser zu dem lyophilisierten Produkt direkt nach dessen chemischer Synthese auf 10 mM Stammlösungen eingestellt. Einige PCRs können von der Verwendung hochgereinigter „PCR-grade“ dNTPs (Roche) profitieren, die weniger als 0,9% Desoxynukleotiddiphosphate (dNDP) enthalten, >99% rein und frei von Verunreinigungen wie modifizierten Nukleotiden und Tetrapyrophosphat sind. Diese (teureren) hochreinen dNTPs können bei der erfolgreichen Amplifikation von PCR-DNA aus Präparaten mit sehr geringen Kopienzahlen der Ziel-DNA hilfreich sein.
In einigen PCR-Anwendungen und -Protokollen kann eines der vier dNTPs durch ein analoges dNTP, z. B. Inosin, 7-Desaza-2′-Desoxyguanosin, oder ein modifiziertes dNTP, z. B. ein Biotin-, Fluorophor- oder radioaktiv markiertes dNTP, ersetzt werden. Solche Modifikationen ermöglichen weitere nachgeschaltete Post-PCR-Verarbeitungsanwendungen.