Das Überwiegen des nicht-synonymen A-zu-I-RNA-Editierens in Coleoiden ist nicht-adaptiv

Eine nicht-adaptive Hypothese und ihre Vorhersagen

Betrachten wir eine genomische Position in einer kodierenden Region, die derzeit mit G besetzt ist und kein A akzeptiert (siehe obere Reihe in Abb. 1a). Mit zunehmender Editieraktivität in der Spezies kann eine G-zu-A-Mutation an dieser Stelle neutral und fixiert werden, wenn das resultierende A in einem ausreichend großen Anteil der mRNA-Moleküle wieder zu G editiert wird (siehe mittlere Reihe in Abb. 1a). Nach der Substitution von G zu A wird das hohe Editierungsniveau an der Stelle selektiv beibehalten, da auf mRNA-Ebene eher G als A zulässig ist. Da die obige Situation nur für nicht-synonyme G-zu-A-Substitutionen und das gekoppelte nicht-synonyme A-zu-G-Editing gilt, werden die Anzahl der nicht-synonymen Editing-Stellen und die nicht-synonymen Editing-Werte im Vergleich zu den entsprechenden synonymen Werten aufgebläht. Obwohl in diesem Fall das nicht-synonyme Editing die Fixierung der ansonsten schädlichen G-zu-A-Mutation ermöglicht hat, ist der abgeleitete Genotyp mit einem stark editierten genomischen A nicht fitter als der ursprüngliche Genotyp mit einem genomischen G. Somit ist das Editing nicht adaptiv. Wir haben im obigen Szenario angenommen, dass das Editing-Niveau so hoch ist, dass die ansonsten schädliche G-zu-A-Mutation neutral wird. Es ist auch möglich, dass der Editiergrad nicht hoch genug ist, so dass die G-zu-A-Mutation leicht schädlich ist (siehe untere Zeile in Abb. 1a). Eine leicht schädliche Mutation kann dennoch fixiert werden, und der Editiergrad kann in der nachfolgenden Evolution selektiv erhöht werden. Selbst in diesem Szenario gibt es keinen Netto-Eignungsgewinn zwischen dem ursprünglichen Genotyp mit einem genomischen G und dem abgeleiteten Genotyp mit einem genomischen A, das stark editiert ist. Wir bezeichnen das obige nicht-adaptive Modell, das beide beschriebenen Szenarien beinhaltet, als das Schaden zulassende Modell, weil RNA-Editierung die Fixierung von ansonsten schädlichen Mutationen erlaubt. Obwohl die Möglichkeit des Harm-Permitting durch RNA-Editing mehrfach vorgeschlagen wurde31,38,39,40, insbesondere in Bezug auf das Editing von Organellen-Transkriptomen, fehlen empirische Belege dafür, dass es vollständig oder primär für die Schaffung „adaptiver Signale“ des RNA-Editings verantwortlich ist.

Angesichts der außergewöhnlich hohen Editing-Aktivität in koleoiden Nervengeweben25,27 stellen wir die Hypothese auf, dass das gemeldete Übergewicht an nicht-synonymen Editing durch das schadenserlaubende Modell erklärt wird und nicht adaptiv ist. Um diese Hypothese zu testen, unterteilen wir das nicht-synonyme Editing in zwei Kategorien: restauratives und diversifizierendes41. Beim restaurativen Editing wird der Aminosäurenzustand in einen angestammten Zustand zurückverwandelt (Abb. 1b), während beim diversifizierenden Editing der Aminosäurenzustand in einen nicht angestammten Zustand umgewandelt wird (Abb. 1c). Da restauratives Editing, nicht aber diversifizierendes Editing eine schadenserleichternde Wirkung haben kann, sagt unsere Hypothese voraus, dass das berichtete Übergewicht von nicht-synonymem Editing in Coleoiden auf restauratives, nicht aber diversifizierendes Editing zurückzuführen ist. Insbesondere sagen wir voraus, dass (i) die Häufigkeit der bearbeiteten Stellen bei restaurativem (FR) größer ist als bei synonymem (FS) Editing, und dass (ii) der Median des Editing-Niveaus bei restaurativem (LR) höher ist als bei synonymem (LS) Editing. Ferner sagt sie voraus, dass (iii) die Häufigkeit der bearbeiteten Stellen bei diversifizierendem (FD) nicht größer ist als bei synonymem (FS) Editing, und dass (iv) das mittlere Editing-Niveau bei diversifizierendem (LD) nicht höher ist als bei synonymem (LS) Editing. Im Gegensatz dazu enthält die adaptive Hypothese keine spezifischen Vorhersagen über FR und LR, sondern sagt voraus, dass FD und LD jeweils größer sind als FS und LS. Es ist bemerkenswert, dass zwar nur restauratives Editieren schadenserleichternd sein kann, aber nicht jedes restaurative Editieren notwendigerweise schadenserleichternd ist. Zum Beispiel wäre das restaurative Editing neutral, wenn es eine neutrale G-zu-A-Substitution wiederherstellt.

Muster des restaurativen und diversifizierenden Editierens

Um die nicht-adaptive Hypothese zu testen, analysierten wir die veröffentlichten neuralen Transkriptome von sechs Molluskenarten27, deren phylogenetische Beziehungen in Abb. 2a dargestellt sind. Unter ihnen weisen die vier Coleoide eine weit verbreitete kodierende A-zu-G-Bearbeitung in neuronalen Geweben auf, während die beiden Außengruppen wesentlich weniger Bearbeitungsstellen aufweisen27.

Wir identifizierten 3587 eins-zu-eins orthologe Gene in diesen sechs Arten und leiteten die kodierenden Vorgängersequenzen an allen inneren Knoten des Artenbaums ab (Abb. 2a). Wir betrachteten ein nicht-synonymes Editing-Ereignis in einem äußeren Knoten des Baumes, das den Aminosäurestatus von X zu Y verändert, als restaurativ, wenn der abgeleitete genomische, sequenzbasierte Aminosäurestatus an jedem Knoten des Baumes, der dem fokalen äußeren Knoten vorgelagert ist, Y ist (Abb. 1b; siehe auch Methoden), oder diversifizierend, wenn Y an keinem Knoten des Baumes, der dem fokalen äußeren Knoten vorgelagert ist, vorhanden ist (Abb. 1c). Es sei darauf hingewiesen, dass diese Definitionen auf Aminosäurenzuständen basieren und nur auf nicht-synonymes Editing angewendet werden. Synonymes Editing ist vermutlich neutral und muss daher nicht in restauratives und diversifizierendes Editing unterteilt werden. Darüber hinaus wäre eine Trennung der synonymen Editierung in die beiden Kategorien weniger genau, da die Zuverlässigkeit bei der Ableitung von Vorgängersequenzen an synonymen Stellen geringer ist. Von den beiden Kategorien nicht-synonymer Editierstellen ist die Zahl der diversifizierenden Editierstellen 8,4-13,9 mal so hoch wie die der restaurativen Editierstellen in den vier Coleoiden (ergänzende Tabelle 1).

In jedem der vier Coleoide sind FR und LR signifikant größer als FS (Abb. 2b) bzw. LS (Abb. 2c). Dagegen ist FD signifikant kleiner als FS (Abb. 2b), während sich LD nicht signifikant von LS unterscheidet (Abb. 2c). Diese Ergebnisse bestätigen alle vier Vorhersagen der nicht-adaptiven Hypothese und stehen im Widerspruch zu den Vorhersagen der adaptiven Hypothese, was stark darauf hindeutet, dass die überwiegende Anzahl nicht-synonymer Änderungen in Coleoiden durch das Harm-Permitting-Modell erklärt wird und nicht-adaptiv ist. Abbildung 2c zeigt, dass LR zwar in jedem Coleoid signifikant höher als LS ist, aber unter 2,5 % liegt. Es stellt sich die Frage, ob ein so niedriger Medianwert der restaurativen Bearbeitung schadensbegrenzend sein kann. Wie bereits erwähnt, sind nicht alle restaurativen Bearbeitungen notwendigerweise schadensbegrenzend, was erklären könnte, warum die LR nicht besonders hoch ist. Nichtsdestotrotz zeigt Abb. 2c einen größeren Anteil an restaurativem Editing als synonymes Editing mit nennenswertem Editing-Niveau. Zum Beispiel haben beim Tintenfisch 33,37 % und 13,31 % der restaurativen Editierstellen, aber nur 22,97 % und 6,74 % der synonymen Editierstellen Editierstufen >5 % bzw. >20 %. Abhängig von der Schädlichkeit der G-zu-A-Mutation und der relativen Dominanz der A- und G-Isoformen könnten diese beträchtlichen Mengen an A-zu-G-Editing die Fixierungswahrscheinlichkeit der G-zu-A-Mutation erheblich erhöhen. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die Harm-Permitting-Hypothese als Alternative zur adaptiven Hypothese vorgeschlagen wird. Wenn ein moderates Maß an nicht-synonymem Editing, wie von der adaptiven Hypothese behauptet, vorteilhaft sein könnte, gibt es keinen Grund, warum es nicht schadensverursachend sein könnte. Darüber hinaus unterstützt der allgemeine Trend von LR > LS und LD < LS die Harm-Permitting-Hypothese im Vergleich zur adaptiven Hypothese.

Um die Robustheit unserer Ergebnisse zu prüfen, haben wir vier zusätzliche Analysen durchgeführt. Zunächst untersuchten wir jeweils die für jedes der vier Coleoide spezifischen Editierstellen, da artspezifische Editierereignisse ein ähnliches evolutionäres Alter haben, was fairere Vergleiche ermöglicht. Die erzielten Ergebnisse sind denen in Abb. 2 sehr ähnlich und sind robust gegenüber möglichen Fehlidentifizierungen von artspezifischem Editing (ergänzende Abb. 1). Zweitens untersuchten wir Editing-Ereignisse, die aus einzelnen Geweben in Bimac identifiziert wurden. FR > FS und FD < FS sind gewebeübergreifend, aber die Vergleiche der Editing-Ebenen sind größtenteils nicht signifikant, was wahrscheinlich auf die verringerte statistische Aussagekraft infolge des geringeren Stichprobenumfangs zurückzuführen ist (ergänzende Tabelle 2). Drittens haben wir synonyme Editierstellen in der einen Hälfte des Gensatzes mit nicht-synonymen Editierstellen in der anderen Hälfte verglichen, da die Editierniveaus benachbarter Editierstellen durch eine Mutation mitbeeinflusst werden können, was die statistische Aussagekraft beim Vergleich synonymer mit nicht-synonymen Editierstellen verringern würde. Konkret ordneten wir alle Gene nach dem dN/dS-Verhältnis zwischen Kraken- und Tintenfisch-Orthologen und gruppierten Gene mit ungeraden Rängen in Bin 1 und solche mit geraden Rängen in Bin 2. Anschließend verglichen wir synonyme Editierstellen in Bin 1 mit nicht-synonymen Editierstellen in Bin 2 sowie synonyme Editierstellen in Bin 2 mit nicht-synonymen Editierstellen in Bin 1. Die Ergebnisse (ergänzende Abb. 2) sind ähnlich wie bei allen Editierstellen (Abb. 2). Viertens untersuchten wir FR/FS und FD/FS in fünf Editierbereichen (0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80% und 80-100%) in jedem Coleoid (ergänzende Abb. 3). Sowohl FR/FS als auch FD/FS nehmen im Allgemeinen mit dem Grad der Bearbeitung zu. Obwohl FR/FS fast immer größer als 1 ist, ist FD/FS kleiner als 1, außer wenn der Bearbeitungsgrad 60 % übersteigt. Es ist wichtig zu betonen, dass nur ein paar Prozent der diversifizierenden Editierstellen in einem Coleoid in diesen Editierbereich fallen (ergänzende Tabelle 3), was darauf hindeutet, dass die überwiegende Mehrheit der diversifizierenden Editierung nicht adaptiv ist (siehe unten für quantitative Schätzungen).

Beschleunigte nicht-synonyme G-zu-A-Substitutionen

Das Harm-Permitting-Modell sagt außerdem voraus, dass die Rate der nicht-synonymen G-zu-A-Substitutionen im Verhältnis zu den synonymen G-zu-A-Substitutionen (dN/dS für G-zu-A) erhöht sein sollte, weil die hohe Editing-Aktivität einige ansonsten schädliche nicht-synonyme G-zu-A-Mutationen akzeptabel macht. Darüber hinaus sollte diese Erhöhung bei Genen, die ausschließlich in neuronalen Geweben exprimiert werden, besonders ausgeprägt sein, nicht aber bei Genen, die in neuronalen Geweben nicht exprimiert werden, da die hohe Editing-Aktivität bisher nur in neuronalen Geweben beobachtet wurde25,27. Da jedoch nur Bimac und Tintenfisch über RNA-Sequenzierungsdaten aus verschiedenen nicht-neuralen Geweben verfügen und da Gene, die in neuralen Geweben nicht exprimiert werden, nicht in den Transkript-Sequenzdaten von Tintenfisch und Sepia enthalten sind und daher von unseren Alignments ausgeschlossen wurden, mussten wir zwei Gruppen von Genen mit relativ hoher bzw. relativ niedriger Spezifität für die neurale Expression definieren. Die Gene mit hoher neuraler Expressionsspezifität werden ausschließlich in neuralen Geweben des Bimac oder des Tintenfischs exprimiert, während die Gene mit niedriger neuraler Expressionsspezifität sowohl in neuralen als auch in nicht-neuralen Geweben des Bimac und des Tintenfischs exprimiert werden. Das Harm-Permitting-Modell sagt voraus, dass dN/dS für G-to-A bei Genen mit relativ hoher neuraler Expressionsspezifität größer ist als bei solchen mit relativ niedriger neutraler Expressionsspezifität. Da der harm-permitting-Effekt nur dann auftritt, wenn eine G-zu-A-Mutation an einer Stelle ohne Editing schädlich ist, haben wir uns auf nicht-synonyme Stellen konzentriert, die in den beiden Outgroup-Spezies konserviert sind (d. h. Nautilus, Seehase und der unmittelbare Vorgängerknoten der Fokus-Spezies haben denselben Zustand vor dem Editing), um die Sensitivität unseres Tests zu erhöhen. Außerdem sollte die Erhöhung von dN/dS spezifisch für G-zu-A-Änderungen sein, da die potenziellen Schäden anderer Änderungen wie C/T-zu-A und G-zu-C/T nicht durch A-zu-G-Editing gemildert werden können.

Zu diesem Zweck haben wir alle sechs Zweige betrachtet, die vom gemeinsamen Vorfahren der vier Coleoide abstammen. Wir berechneten dN und dS für jeden dieser Zweige unter Verwendung der vorhandenen und abgeleiteten Vorgängersequenzen und berechneten dann dN/dS, indem wir das gesamte dN durch das gesamte dS dieser Zweige dividierten. Zur Unterstützung unserer Vorhersage ist dN/dS für G-zu-A-Änderungen bei Genen mit relativ hoher neuronaler Expressionsspezifität größer als bei solchen mit relativ geringer Spezifität (Abb. 3). Durch 200-maliges Bootstrapping der beiden Gengruppen konnten wir feststellen, dass der oben genannte Unterschied statistisch signifikant ist (P = 0,015). Im Gegensatz dazu besteht kein signifikanter Unterschied in dN/dS zwischen den beiden Gengruppen, wenn C/T-zu-A-Veränderungen oder G-zu-C/T-Veränderungen berücksichtigt werden (Abb. 3). Es ist bemerkenswert, dass dN/dS < 1 in allen Fällen in Abb. 3 ist, was mit dem Schaden-erlaubenden Modell übereinstimmt, das keine positive Selektion beinhaltet.

Der potenzielle Nutzen des gemeinsamen Editierens zwischen den Arten

Es wurde vorgeschlagen, dass gemeinsames Editieren zwischen mehreren Arten wahrscheinlich von Vorteil ist, da der Editierstatus ansonsten wahrscheinlich nicht evolutionär konserviert wird36. Unterstützt wurde diese Vermutung durch die Feststellung, dass selbst bei Säugetieren, bei denen die meisten nicht-synonymen Editierungen neutral oder schädlich zu sein scheinen, die Häufigkeit der konservierten Stellen, die nicht-synonymen Editierungen unterliegen, sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen die Häufigkeit der konservierten Stellen, die synonymen Editierungen unterliegen, bei beiden Arten deutlich übersteigt36. Ein ähnliches Phänomen wurde bei Fruchtfliegen beobachtet23. In Coleoiden wird ein beträchtlicher Teil der nicht-synonymen Editing-Stellen von mindestens zwei Arten gemeinsam genutzt, und stark editierte Stellen werden in der Regel gemeinsam genutzt27. Um die potenziellen evolutionären Kräfte zu verstehen, die das RNA-Editing an bestimmten Stellen über mehrere Coleoide hinweg aufrechterhalten, haben wir das gemeinsame Editing einer Gruppe von zwei oder mehr Arten analysiert.

Ein nicht-synonymes Editing-Ereignis, das von einer Gruppe von Arten geteilt wird und den Aminosäurestatus von X zu Y verändert, wird als restaurativ betrachtet, wenn der abgeleitete Aminosäurestatus auf der Grundlage der genomischen Sequenz an jedem Knoten des Baums, der dem jüngsten gemeinsamen Vorfahren der Gruppe entstammt, Y ist, oder als diversifizierend, wenn Y an keinem dieser Vorgängerknoten vorhanden ist. Bei der Untersuchung des gemeinsamen Editierens haben wir die durchschnittliche Editierstufe in der Gruppe, in der das Editieren gemeinsam erfolgt, berücksichtigt. Bei den gemeinsamen Editierstellen von Tintenfisch und Bimac und den gemeinsamen Stellen von Tintenfisch und Sepia sind FR und FD beide deutlich kleiner als FS (Abb. 4a). Im Gegensatz dazu sind LR und LD beide deutlich größer als LS (Abb. 4b). Für die Teilmenge der oben genannten gemeinsamen Schnittplätze, die von allen vier Coleoiden gemeinsam genutzt werden, sind FD und LD signifikant größer als FS (Abb. 4a) und LS (Abb. 4b), ebenso wie FR (Abb. 4a) und LR (Abb. 4b). Ein signifikant größerer FD als FS für gemeinsames Editing könnte durch (i) positive Selektion, die die anfängliche Fixierung von Mutationen fördert, die zu nicht-synonymen Editing führen, und/oder (ii) reinigende Selektion, die den Verlust von vermutlich vorteilhaftem nicht-synonymen Editing verhindert, verursacht werden; daher ist dies ein klarer Indikator für adaptives nicht-synonymes Editing. Eine signifikant größere LD als LS für gemeinsames Editing könnte verursacht werden durch (i) positive Selektion, die die Erhöhung des Editing-Niveaus von vermutlich vorteilhaftem nicht-synonymen Editing fördert, (ii) reinigende Selektion, die die Abnahme des Editing-Niveaus von vermutlich vorteilhaftem nicht-synonymen Editing verhindert, (iii) reinigende Selektion, die bevorzugt den Verlust von hochgradigem nicht-synonymen Editing verhindert, vermutlich weil ein hohes Editing-Niveau mit größeren Vorteilen verbunden ist als ein niedriges Editing-Niveau, und/oder (iv) positive Selektion, die bevorzugt den Verlust von niedriggradigem nicht-synonymen Editing fördert, wahrscheinlich weil eine A-zu-G-Substitution an einer editierten Stelle bevorzugt wird, insbesondere wenn das Editing-Niveau niedrig ist. Unabhängig davon deutet eine signifikant höhere LD als LS auch auf adaptives nicht-synonymes Editing hin. Daher zeigen alle vier Coleoide starke und konsistente adaptive Signale für nicht-synonymes Editing, was darauf hindeutet, dass ein großer Anteil adaptiv ist. Im Vergleich dazu zeigen das gemeinsame nicht-synonyme Editieren von Tintenfisch und Bimac und das gemeinsame Editieren von Tintenfisch und Sepia einige, aber nicht alle Anzeichen von Anpassung, und die adaptiven Signale sind viel schwächer, was darauf hindeutet, dass nur ein kleinerer Anteil adaptiv ist.

Was ist der allgemeine Nutzen des gemeinsamen Editierens, das adaptive Signale zeigt? Es gibt zwei Hypothesen. Erstens könnte das Editing aufgrund der dadurch entstehenden Proteinvielfalt innerhalb des Organismus von Vorteil sein25,27,32,42. Das heißt, das Editing ermöglicht das Vorhandensein von zwei Protein-Isoformen pro editierter Stelle in einem Organismus, was analog zum Heterozygotenvorteil bei polymorphen Stellen zu einer höheren Fitness führen kann. Alternativ bietet das Editing eine neue Isoform, die möglicherweise einfach fitter ist als die uneditierte Isoform. Bei dieser letzteren Hypothese ist der Nutzen des Editierens mit dem einer Nukleotidsubstitution vergleichbar. Um zwischen diesen beiden Hypothesen zu unterscheiden, konzentrierten wir uns auf die Stellen, die in mindestens drei der vier Coleoide editiert wurden, da nach dem Parsimony-Prinzip an diesen Stellen im gemeinsamen Vorfahren der vier Arten Editing stattgefunden haben sollte (Abb. 2a). Anschließend schätzten wir die Häufigkeit der Ersetzung von Editing durch eine A-zu-G-Substitution in jeder der vier Arten. Es wird erwartet, dass solche Ersetzungen bei synonymen Schnitten mehr oder weniger neutral sind. Bei nicht-synonymem Editing sind solche Ersetzungen nach der ersten Hypothese aufgrund des Verlusts der Proteinvielfalt schädlich, nach der zweiten Hypothese jedoch neutral. Daher sagt die erste Hypothese eine geringere Häufigkeit solcher Ersetzungen für nicht-synonymes Editing als für synonymes Editing voraus, während die zweite Hypothese gleiche Häufigkeiten solcher Ersetzungen für synonymes und nicht-synonymes Editing vorhersagt.

Interessanterweise ist die Häufigkeit solcher Ersetzungen für nicht-synonymes Editing signifikant größer als die für synonymes Editing in einem exakten Test von Fisher mit zwei Schwänzen (Abb. 4c und ergänzende Tabelle 4). Da es die gemeinsame diversifizierende Bearbeitung ist, für die die Art des Nutzens in Frage steht, beschränkten wir die Analyse nur auf die diversifizierende Bearbeitung, erhielten aber ein ähnliches Ergebnis (Abb. 4c und ergänzende Tabelle 4). Es ist bemerkenswert, dass keine synonyme oder nicht-synonyme Editierung durch eine A-zu-C/T-Substitution in dieser Gruppe von Sites ersetzt wurde (ergänzende Tabelle 4). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass nicht-synonymes Editing eher durch eine A-zu-G-Substitution ersetzt wird als synonymes Editing, wahrscheinlich weil ein genomisches G besser ist als ein genomisches A, das nicht in allen mRNA-Molekülen zu G editiert werden kann. Mit anderen Worten: Unsere Ergebnisse widerlegen die erste Hypothese und legen nahe, dass der Nutzen des adaptiven A-zu-G-Editierens dem der gleichen Nukleotid-Substitution ähnelt, auch wenn der Umfang des Nutzens bei ersterem geringer ist als bei letzterem. Darüber hinaus deutet das Ergebnis in Abb. 4c darauf hin, dass die signifikant größere FD als FS für Editing, die alle vier Coleoide gemeinsam haben, besser durch positive Selektion erklärt werden kann, die die anfängliche Fixierung von Mutationen fördert, die zu vorteilhaftem nicht-synonymen Editing führen, als durch reinigende Selektion, die den Verlust von vorteilhaftem nicht-synonymen Editing verhindert.