Citrobacter freundii Fitness während einer Blutstrominfektion

Sammlung von Citrobacter BSI-Isolaten

Im Vergleich zu anderen gramnegativen Spezies, die regelmäßig BSI verursachen, sind nur wenige Informationen über die Physiologie von C. freundii im Wirtsumfeld verfügbar. Um diesen Mangel zu beheben, sammelten wir zunächst acht Isolate des C. freundii-Komplexes von Patienten mit BSI innerhalb des University of Michigan Health System. Die auf ribosomaler RNA basierende Phylogenie ist in der Lage, drei Gruppen von Citrobacter-Arten zu unterscheiden, von denen die Gruppe I mindestens acht Arten umfasst und C. freundii23,24 einschließt. Auf 16S rRNA-Sequenz und Massenspektrometrie basierende Identifizierungsansätze bieten jedoch nur eine begrenzte phylogenetische Auflösung innerhalb dieser Gruppe von Citrobacter-Arten. Daher wurden die in dieser Studie verwendeten Isolate mit Hilfe einer Multilocus-Sequenzanalyse weiter untersucht. Von den acht gesammelten Isolaten waren sechs eng mit etablierten C. freundii-Stämmen geclustert (Abb. 1) und wiesen eine durchschnittliche Nukleotididentität von >98 % mit dem Typstamm ATCC 8090 auf, was über dem üblicherweise akzeptierten Grenzwert von 95 % für Isolate derselben Art liegt. Von den beiden verbleibenden Isolaten war UMH17 am engsten mit dem Citrobacter pasteurii-Typstamm CIP 55.13 und UMH18 mit Citrobacter werkmanii-Stämmen geclustert.

C. freundii Bakteriämie

Vor der Untersuchung der Fitnessanforderungen von Citrobacter während der BSI wurde ein Mäusemodell der Bakteriämie auf der Grundlage früherer Arbeiten mit anderen enterischen Arten entwickelt25. Von den Citrobacter-BSI-Isolaten wurden die Stämme UMH14 und UMH15 als Kandidaten für diese Studie ausgewählt. Das Isolat UMH14 zeigte 24 Stunden nach der Injektion in die Schwanzvene eine konsistentere dosisabhängige Kolonisierung von Milz und Leber (Abb. S1) und wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Es war auch notwendig, das Infektionsmodell auf potenzielle Besiedlungsengpässe zu testen, bevor der Beitrag einzelner C. freundii-Gene zur Fitness unter Verwendung einer großen Sammlung von Transposon-Mutanten bewertet werden konnte. Es wurde eine spontane Nalidixinsäure-resistente Mutante von UMH14 (UMH14Nal) isoliert und festgestellt, dass sie während der Co-Kultur mit dem Elternstamm in reichhaltigem Medium eine gleichwertige In-vitro-Fitness aufweist (Abb. S2). Um festzustellen, ob sich eine vielfältige Mutantenpopulation im Blutkreislauf etablieren kann, ohne dass es zu einem stochastischen Verlust einzelner Klone kommt, wurden die Stämme UMH14Nal und UMH14 in verschiedenen Verhältnissen gemischt und Mäusen beimpft. Nach 24 Stunden wurden Verhältnisse von bis zu 1:10.000 (UMH14Nal:UMH14) ohne spontanen Verlust des unterrepräsentierten Stammes in der Milz toleriert (Abb. S2), was darauf hindeutet, dass eine einzelne Maus mit diesem Modell mindestens 10.000 einzigartige Transposon-Mutanten bei einer Gesamtdosis von 5 × 107 Bakterien aufnehmen kann.

Um Citrobacter-Fitnessgene im Bakteriämiemodell zu identifizieren, wurden fünf Pools von zufälligen Transposon-Insertionsmutanten, die >44.000 einzigartige Insertionsstellen repräsentieren, in Mäuse injiziert und die Bakterien, die die Milz besiedelten, nach 24 Stunden wiedergewonnen (Abb. S3). Die relative Häufigkeit einzelner Transposon-Mutanten im Inokulum und in den Milzausscheidungen, wie sie durch Hochdurchsatz-Sequenzierung bestimmt wurde, diente zur Identifizierung von Genen, die zum bakteriellen Überleben in dem Modell beitragen. Insgesamt 177 durch Transposons zerstörte Gene führten zu einem signifikanten Verlust an Fitness, und neun Gene waren mit einer erhöhten bakteriellen Fitness verbunden, wenn sie mutiert waren (Fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (Daten S1). Eine zweite Analyse mit diesem Datensatz identifizierte 546 chromosomal kodierte mutmaßlich essenzielle Gene, für die die Anzahl der Reads in der Eingabepopulation signifikant niedriger war als aufgrund der verfügbaren TA-Stellen und der Größe der Bibliothekspopulation erwartet (logFC <-5,17) (Daten S2). Unter Verwendung dieses Modells der opportunistischen und systemischen Infektion wurde erwartet, dass die Mehrheit der identifizierten Fitnessfaktoren eher physiologische Kernprozesse als prototypische Virulenzfaktoren (z. B. Proteintoxine oder Adhäsine) darstellen würden. Tatsächlich spiegelte die Kategorisierung der 177 Gene, die mit signifikanten Fitnessdefekten assoziiert waren, nach Clustern orthologer Gruppen (COG) die Dominanz von Stoffwechselwegen und zellulären Erhaltungsfunktionen wider, die während der Bakteriämie von C. freundii erforderlich sind (Abb. 2). Etwa die Hälfte der identifizierten Fitnessgene lässt sich grob in fünf COG-Kategorien einordnen, die Energieproduktion, Aminosäurestoffwechsel, DNA-Replikation und -Reparatur, Translation sowie Zellwand- und Membranbiogenese umfassen.

Validierung einzelner Fitness-Gen-Mutanten

Der Beitrag einzelner Genprodukte zur Fitness von C. freundii wurde mit unabhängigen Deletions-Insertions-Mutationen in ausgewählten UMH14-Genen bestätigt (Tabelle 1). Alle konstruierten Stämme, über die hier berichtet wird, wiesen keine groben Replikationsdefekte auf, wie durch Wachstum in reichem Medium festgestellt wurde (Abb. S4). Für jedes in Tabelle 1 aufgeführte Gen wurde die Fitness durch Koinfektion einzelner Mutanten mit dem UMH14-Elternstamm gemessen. Fünf der sieben ursprünglich getesteten Mutanten wiesen entweder in der Milz oder in der Leber einen statistisch signifikanten Wettbewerbsnachteil auf (Abb. 3A) und bestätigten damit die Ergebnisse des Transposon-Screens. Die znuB-Mutante wurde hier als Negativkontrolle für die Validierung ausgewählt, da die Ergebnisse des Transposon-Screens darauf hindeuteten, dass mit diesem Gen kein Fitnessdefekt verbunden war, obwohl andere Bakterienarten den Beitrag des ZnuABC-Zinktransportsystems zur Infektion von Mäusen belegen26,27,28. Im Wettbewerb mit UMH14 wies die znuB-Mutante keinen signifikanten Fitnessdefekt auf, was den erwarteten Ergebnissen entsprach. Die benachbarten Gene znuA (Fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) und znuC (Fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) von UMH14 verursachten ebenfalls entweder keinen oder einen minimalen Fitnessdefekt, wenn sie durch Transposon-Insertion mutiert wurden (Daten S1).

Die Mutation des tatC-Gens, das für eine Komponente des Zwillings-Arginin-Translokationssystems kodiert, führte zu dem größten Fitnessverlust unter allen getesteten Mutanten (Abb. 3). Um festzustellen, ob die verminderte Fitness dieser Mutante durch genetische Komplementierung wiederhergestellt werden kann, wurde das Plasmid pBBR1MCS-5, das den offenen Leserahmen von tatC enthält, in die tatC-Mutante eingeführt und die relative Fitness des resultierenden Stammes getestet. Die tatC-Mutante zeigte zunächst einen 67-fachen Fitnessdefekt in der Milz im Vergleich zum Wildtyp-Stamm (Abb. 3A), während die komplementierte tatC-Mutante unter den gleichen Bedingungen nur einen zweifachen Fitnessdefekt aufwies (Abb. 3B). Auch in der Leber war die komplementierte tatC-Mutante im Vergleich zu UMH14 nicht signifikant außer Konkurrenz. Es ist bekannt, dass das pBBR1MCS-5 Elternplasmid während der Infektion ohne Selektion stabil gehalten wird29 , und die In-vitro-Kultur der C. freundii tatC-Mutante, die entweder pBBR1MCS-5 oder das tatC+ Komplementierungsplasmid enthielt, zeigte keinen nennenswerten Verlust des Plasmids über 24 Stunden ohne Selektion (Abb. S5). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse eindeutig die Notwendigkeit der TatC-Funktion während der Citrobacter-Bakteriämie.

Erhaltung von Fitnessgenen unter Citrobacter-Isolaten

Im Verlauf dieser Studie wurde die vollständige Genomsequenz jedes Citrobacter-Isolats bestimmt und das vorhergesagte Proteom jedes Stammes mit UMH14 als Referenz verglichen. Von den 4.666 vorhergesagten Genprodukten, die auf dem UMH14-Chromosom kodiert werden, sind 3.742 mit ≥95% Identität zwischen allen C. freundii-Isolaten in dieser Studie konserviert (Abb. 4A). Die Anzahl der konservierten Proteine (≥95% Identität) zwischen allen Stämmen sinkt auf 2.545, wenn die vorhergesagten Proteome von UMH17 und UMH18 einbezogen werden, was mit der Platzierung dieser Isolate außerhalb des C. freundii-Zweiges durch Multilocus-Sequenzanalyse übereinstimmt (Abb. 1). Die Konservierung der UMH14-Fitnessfaktoren war ebenfalls hoch, wobei 145 der vorhergesagten 177 Proteine mit einer Aminosäureidentität von ≥95 % zwischen den acht Bakterienstämmen konserviert waren (Abb. 4B), einschließlich aller sieben der ursprünglichen Fitnessfaktoren, die für die Validierung ausgewählt wurden (Tabelle 1 und Abb. 3). Wenn man UMH17 und UMH18 aus der Betrachtung herausnimmt, erhöht sich die Zahl der konservierten Fitnessfaktoren auf 162 (92 %). Diese Ergebnisse deuten auf eine Überlebensstrategie von Citrobacter während einer Bakteriämie hin, die weitgehend von konservierten Proteinen innerhalb der Art abhängt. Interessanterweise waren nur wenige Fitnessfaktoren innerhalb dieser Untergruppe von Stämmen völlig einzigartig (<30% Identität) für UMH14. Ein bemerkenswertes Beispiel ist ein mutmaßliches Drei-Gene-Operon (CUC46_23440-CUC46_23450) mit beobachteten Fitnessdefekten zwischen dem 6- und 14-fachen. Alle drei offenen Leserahmen kodieren für hypothetische Proteine, und nur CUC46_23450 kodiert für eine konservierte Domäne mit einer zugewiesenen Funktion (cd01713, Phosphoadenosin-Phosphosulfat-Reduktase).

DNA-Rekombinations- und Reparaturwege

Eines der Ziele dieser Studie war es, konservierte biologische Wege zu identifizieren, an denen mehrere Bakteriämie-Fitnessfaktoren beteiligt sind. Die Enzymkomplexe RecBCD und RuvABC, die an der DNA-Rekombination und -Reparatur beteiligt sind, stellen ein solches Beispiel dar. Das RecBCD-Enzym ist an Duplex-DNA-Enden aktiv und wird für die Prozesse der homologen Rekombination und der rekombinanten DNA-Reparatur benötigt. Im Zusammenhang mit diesen Funktionen erleichtert das RuvABC-Enzym die Migration und Auflösung von Holliday-Junction-Verzweigungen30,31. Die Transposon-Insertion in recB, recC oder recD führte zu einer 6-8-fachen Verringerung der Fitness, und die Störung von ruvA und ruvC durch Transposon-Insertion führte zu einem >30-fachen Verlust der Fitness (Daten S1). Wichtig ist, dass der ruvA-Fitnessdefekt durch eine Konkurrenzinfektion gegen den Wildtyp-Stamm mit einer unabhängig konstruierten Mutante bestätigt wurde (Abb. 3A). Innerhalb der beiden Multiproteinkomplexe wurde nur RuvB in unserem Datensatz nicht als signifikanter Fitnessfaktor identifiziert. Von beiden Proteinkomplexen ist bekannt, dass sie an der Auflösung von blockierten oder kollabierten DNA-Replikationsgabeln beteiligt sind, die während der normalen Chromosomensynthese auftreten30. Wichtig ist jedoch, dass die ruvA-Mutante während der schnellen Replikation in reichem Medium ähnlich wuchs wie der Wildtyp-Stamm (Abb. S4). Es ist verlockend, darüber zu spekulieren, dass bakterielle DNA-Schäden, die in der Wirtsumgebung auftreten, möglicherweise durch die von Immunzellen vermittelte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, ebenfalls zum Bedarf an diesen Komplexen beitragen.

Das Zwillings-Arginin-Translokationssystem

Das Zwillings-Arginin-Translokationssystem funktioniert bei gramnegativen Bakterienarten, um gefaltete Proteine durch die Zytoplasmamembran zu sezernieren. Die Rolle von TatC in diesem konservierten Multiproteinsystem besteht in der Erkennung von Sekretionssignalsequenzen für Proteine, die über diesen Weg exportiert werden. Nachdem der signifikante Einfluss des TatC-Gens auf die In-vivo-Fitness von C. freundii nachgewiesen wurde (Abb. 3), wurde angenommen, dass die vom Tat-System sezernierten Proteine auch für die Fitness im Mausmodell erforderlich sein könnten. Um mutmaßliche von Tat sezernierte Proteine zu identifizieren, wurde die N-terminale Sequenz jedes der 177 Fitnessfaktoren mit Hilfe der Vorhersagesoftware TatP 1.0 analysiert32. Zwei Gene, CUC46_16565 und CUC46_16060, wurden als Kodierer von Tat-abhängigen Signalpeptiden mit Zwillingsarginin-Motiven identifiziert. Das Produkt CUC46_16565 ist zu 94 % mit dem SufI-Protein von E. coli identisch, wobei das Zwillingsargininmotiv und der hydrophobe Teil des Signalpeptids zu 100 % erhalten sind33. Das SufI-Gen von C. freundii wurde mutiert, und die Fitness wurde im Wettbewerb mit dem UMH14-Elternstamm bewertet, um festzustellen, ob ein Teil des Fitnessdefekts, der mit dem Verlust von TatC verbunden ist, auf die Störung der SufI-Funktion zurückgeführt werden kann (Abb. 5A). Tatsächlich wurde der sufI-Mutantenstamm im Vergleich zum Wildtypstamm in der Milz um das 7-fache und in der Leber um das 17-fache verdrängt. Da jedoch die Fitnesskosten der tatC-Mutation im Wettbewerb mit Wildtyp-Bakterien zwischen dem 67-fachen und dem 112-fachen lagen (Abb. 5A) 3), deuten die vergleichsweise geringen Fitnesskosten der SufI-Mutation darauf hin, dass zusätzliche Tat-abhängige Substrate ebenfalls zur Fitness beitragen können. Versuche, eine Tat-abhängige Sekretion von SufI in C. freundii zu etablieren, scheiterten an offensichtlichen Toxizitätsproblemen im Zusammenhang mit der Expression eines C-terminalen FLAG-Epitiope-getaggten SufI-Konstrukts, insbesondere in dem tatC-Mutantenstamm (Daten nicht gezeigt). SufI wurde jedoch in zahlreichen Studien zur Charakterisierung des E. coli-Tat-Systems als Modell des Tat-sezernierten Proteins verwendet.

Der zweite potenzielle, von CUC496_16060 kodierte, von Tat sezernierte Fitnessfaktor, der identifiziert wurde, ist eine vorhergesagte Prolin-Aminopeptidase (PRK10879), die zur PepP-Superfamilie gehört. Ein mutierter Stamm, dem das PepP-Gen fehlte, wurde in der Milz um das ca. 3-fache und in der Leber um das ca. 2-fache verdrängt, aber der beobachtete Fitnessnachteil im Vergleich zum Wildtyp war statistisch nicht signifikant (Abb. 5A). Nichtsdestotrotz wurde die subzelluläre Lokalisierung von PepP mit Hilfe eines C-terminalen FLAG-Epitop-markierten Derivats auf einem Multikopie-Plasmid (PepPFLAG) bestimmt. Unerwartet niedrige Konzentrationen von PepPFLAG wurden in der tatC-Mutante im Vergleich zu UMH14 nachgewiesen; das PepPFLAG-Fusionsprotein wurde jedoch in erster Linie in der zytoplasmatischen Fraktion beider getesteter Stämme gefunden (Abb. S6), und es wurden keine Hinweise auf eine Tat-abhängige subzelluläre Lokalisierung des PepP-Proteins gefunden. Zusammen mit den Ergebnissen der sufI-Mutantenkonkurrenzinfektion stützen diese Daten die Vorstellung, dass zusätzliche Tat-abhängige Fitnessfaktoren in C. freundii vorhanden sind oder dass der kumulative Verlust der Proteintranslokation über das Tat-System den Funktionsverlust für ein einzelnes Substrat überwiegt.

Einer der vorherrschenden Phänotypen, der mit Funktionsverlust-Tat-Mutanten in allen Spezies verbunden ist, ist eine Beeinträchtigung der Motilität34,35,36,37. C. freundii ist ein geflaggtes Bakterium, das in einer weichen Agarmatrix schwimmen kann. Die C. freundii tatC-Mutante wies im Vergleich zum Wildtyp-Stamm eine etwa 2-fache Verringerung der Schwimmmotilität auf, und die Schwimmmotilität wurde durch genetische Komplementierung in trans vollständig wiederhergestellt (Abb. 5B,C). Diese Ergebnisse zeigen eindeutig einen Motilitätsdefekt bei fehlender TatC-Funktion; da jedoch in der tatC-Mutante immer noch ein geringes Maß an Schwimmen beobachtet wurde, ist wahrscheinlich eine gewisse Flagellar-Funktion erhalten geblieben. Mit Ausnahme von fliQ deutet das allgemeine Fehlen von Geißel-assoziierten Fitnessgenen, die während der Bakteriämie identifiziert wurden, darauf hin, dass die Bedeutung von tatC für die Fitness von C. freundii weitgehend unabhängig von der in diesem Stamm beobachteten Geißelfunktionsstörung ist.

Metabolische Fitnesswege

Wie bereits erwähnt, wurde für einen beträchtlichen Teil der identifizierten Citrobacter-Fitnessgene eine Funktion in metabolischen Wegen vorhergesagt (Abb. 2). Drei verschiedene Gene, die Komponenten des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels (pfkA), des Fruktose- und Mannosestoffwechsels (mtlD) und der Aminosäurebiosynthese (cysE) repräsentieren, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die bakterielle Cystein-Biosynthese erfolgt aus L-Serin über das Zwischenprodukt O-Acetyl-L-Serin (OAS). Dieser erste Schritt im E. coli-Modellweg wird durch das Enzym CysE O-Acetyltransferase katalysiert, und der Verlust von cysE führt zu einer Cystein-Auxotrophie38,39. Eine C. freundii cysE-Mutante ist ebenfalls nicht in der Lage, sich in einem definierten Medium zu vermehren, dem Cystein fehlt (Abb. 6A), kann aber nahezu Wildtyp-Dichten erreichen, wenn das Medium entweder mit OAS (Abb. 6B) oder Cystein (Abb. 6C) ergänzt wurde. Die genetische Komplementierung der cysE-Mutation führte zu einer teilweisen Wiederherstellung des Wachstums in Abwesenheit von Cystein. Interessanterweise steht das völlige Fehlen von Wachstum bei cysE-mutierten Bakterien in Abwesenheit von OAS oder Cystein in vitro im Gegensatz zu dem partiellen Fitnessdefekt, der während der Infektion beobachtet wurde (Abb. 3A). Dies deutet darauf hin, dass Citrobacter in der Lage sein könnte, diese Metaboliten aus dem Blutkreislauf zu gewinnen, dass jedoch die Unterbrechung des Biosynthesewegs mit Fitnesskosten verbunden ist.

Als Teil unserer Untersuchung des wirtsassoziierten Stoffwechsels von Citrobacter wurde die Fähigkeit dieses Bakteriums untersucht, verschiedene Kohlenstoffquellen zu nutzen. Das Enzym PfkA Phosphofructokinase anderer enterischer Spezies wurde umfassend charakterisiert und stellt den ersten Schritt der Glykolyse dar, der die Phosphorylierung von Fructose-6-Phosphat zu Fructose-1,6-Bisphosphat katalysiert. Bei UMH14 führte die Mutation von pfkA dazu, dass dieser Stamm nicht mehr in der Lage war, sich mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu vermehren (Abb. 6D), was teilweise wiederhergestellt werden konnte, indem pfkA auf einem Multikopie-Plasmid bereitgestellt wurde. Dieser vollständige Verlust der Glukoseverwertung in vitro korrelierte mit einer zweifachen Abnahme der Fitness während der Bakteriämie (Abb. 3A). Da Glukose eine reichlich vorhandene Kohlenstoffquelle im Serum von Säugetieren ist40 , deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Nutzung von Glukose durch Citrobacter während der Infektion eine Rolle spielt, aber auch, dass das metabolische Repertoire von Citrobacter die Nutzung alternativer Kohlenstoff- und Energiequellen erleichtern kann.

Eine zweite enzymatische Aktivität, die Fruktose-6-Phosphat involviert, wurde ebenfalls auf ihren Beitrag zur Citrobacter-Bakteriämie untersucht. Das Mannitol-1-Phosphat-5-Dehydrogenase-Protein, MtlD, ermöglicht die bidirektionale Umwandlung von Mannitol-1-Phosphat und Fructose-6-Phosphat unter Verwendung von NAD+ oder NADH als Kofaktor41,42. Mehrere enterische Bakterienarten können den Zuckeralkohol Mannitol als einzige Kohlenstoffquelle nutzen, nachdem er über ein Hexitol-Phosphoenolpyruvat-abhängiges Phosphotransferase-System transportiert wurde, was zu einer intrazellulären Akkumulation von Mannitol-1-Phosphat führt43,44. Ein möglicher Verbleib von Mannitol-1-phosphat ist die MtlD-abhängige Oxidation zu Fructose-6-phosphat und die anschließende Einschleusung in den glykolytischen Weg. Die mtlD-Mutante von C. freundii zeigte in der Leber von Mäusen eine fünffache Verringerung der Fitness (Abb. 3A), und diese Beobachtung veranlasste Experimente, um festzustellen, ob C. freundii zu dieser Art von Stoffwechsel in vitro fähig ist. UMH14- und mtlD-Derivatstämme wurden in definiertem Medium mit Mannitol kultiviert, und die resultierenden Wachstumskurven zeigen, dass Wildtyp-Bakterien und die komplementierte Mutante in der Lage waren, sich unter diesen Bedingungen zu vermehren, während der mtlD-Stamm dies nicht konnte (Abb. 6E). Wie erwartet war die mtlD-Mutante in der Lage, sich unter aeroben Bedingungen mit Glukose als Kohlenstoffquelle in der Nähe des Wildtyps zu vermehren (Abb. 6F). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse sowohl die Fähigkeit von C. freundii, Mannitol als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen, als auch die Notwendigkeit von mtlD in diesem Prozess.

Gemeinsame Fitness-Strategien zwischen Krankheitserregern in der Blutbahn

Wir haben zuvor die Fitness-Anforderungen eines anderen opportunistischen Krankheitserregers, S. marcescens, anhand eines ähnlichen Mausmodells der Bakteriämie untersucht. Die Ergebnisse der S. marcescens-Studie umfassten die Identifizierung von 212 Fitnessgenen unter Verwendung ähnlicher Techniken wie bei der vorliegenden Arbeit45. Um festzustellen, ob diese Arten gemeinsame Wege für die Fitness während der BSI nutzen, wurden zunächst die vorhergesagten Proteome der beiden Arten verglichen. Proteine wurden als homolog zwischen C. freundii und S. marcescens betrachtet, wenn sie ≥70% Aminosäureidentität über ≥50% der Sequenz aufwiesen. Insgesamt wurden 42 homologe Proteine als signifikante Fitnessfaktoren in beiden Organismen identifiziert (Tabelle S1), wobei eine Reihe unterschiedlicher Funktionen in dieser Liste gemeinsamer Fitnessfaktoren vertreten sind. Insbesondere das RuvA-Protein, dessen Verlust zu einer >10-fachen Abnahme der Fitness von C. freundii durch Konkurrenzinfektion führte (Abb. 3A), wurde zusammen mit RuvC als Fitnessfaktoren in S. marcescens identifiziert. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass die Auflösung von Holliday Junction-Komplexen, möglicherweise während der rekombinanten Reparatur von DNA-Schäden, für die In-vivo-Fitness dieser Organismen wichtig ist. Das Enzym PfkA Phosphofructokinase wurde bei beiden Arten ebenfalls als Fitnessfaktor identifiziert. Wie bei Citrobacter ist auch bei S. marcescens pfkA für die Verwertung von Glukose als einziger Kohlenstoffquelle erforderlich und wurde außerdem für eine optimale bakterielle Replikation in hitzeinaktiviertem Humanserum benötigt45. In beiden Organismen trug pfkA zur Fitness in der Milz bei, wie durch den Transposon-Screen ermittelt wurde. Interessanterweise zeigte die S. marcescens pfkA-Mutante jedoch auch eine ca. 9-fach reduzierte Fitness in der Niere bei einer Konkurrenzinfektion mit dem Wildtyp-Stamm. Im Verlauf dieser Arbeit wurde festgestellt, dass der Wildtyp-Stamm von C. freundii UMH14 im BSI-Modell eine relativ schlechte Besiedlung der Niere aufwies, aber es wurde gezeigt, dass das pfkA-Gen von Proteus mirabilis zur Fitness in der Niere nach einer Harnwegsinfektion beiträgt46. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass es möglich ist, konservierte Fitnessstrategien zwischen Organismen in einer bestimmten Umgebung zu identifizieren. Weitere Arbeiten werden erforderlich sein, um festzustellen, ob diese Genprodukte auch in anderen BSI-verursachenden Organismen benötigt werden und ob diese konservierten Fitnesspfade genutzt werden können.