3.1 OMVs: Composition, Biogenesis, and Functional Roles
OMVs sind widerstandsfähige und diskrete kugelförmige, zweischichtige Lipid-Nanostrukturen mit einem Durchmesser von 10 bis 300 nm, die aus der Zellhülle stammen und nicht in der Lage sind, sich unabhängig zu replizieren (Kulp und Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Abb. 4). Die Ablösung von OMVs wurde erstmals vor mehr als 50 Jahren in transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen beobachtet, die die Ultrastruktur der bakteriellen Zellwand zeigen (Bladen und Waters, 1963; Bayer und Anderson, 1965; Chatterjee und Das, 1967). Es wurde festgestellt, dass diese nanosphärischen Strukturen aus einer einzigen Membran bestehen, die ein elektronendichtes Zentrum umgibt (Work et al., 1966). Andere Studien aus derselben Zeit berichteten ebenfalls über das Vorhandensein von „extrazellulären Kügelchen“ im zellfreien Überstand von E. coli, die unter nährstofflimitierenden Wachstumsbedingungen gezüchtet wurden (Bishop und Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Daher wurde zunächst postuliert, dass die Bildung von OMVs nur unter Stressbedingungen stattfindet. Weitere Untersuchungen zeigten jedoch eindeutig, dass OMVs auch unter nicht stressigen Bedingungen nachgewiesen werden können, und zwar sowohl in Laboratorien als auch in der Umwelt (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). Heute weiß man, dass OMVs zu einer Vielzahl biologischer Schlüsselfunktionen beitragen, und eine der ersten Funktionen, die jemals für OMVs beschrieben wurden, ist ihre Beteiligung an der Pathogenese, insbesondere als Transportvehikel für Virulenzfaktoren (Übersicht in Ellis und Kuehn, 2010). Im Laufe der Jahre wurden OMVs je nach Art und Kulturbedingungen weitere Funktionen zugeschrieben, darunter die Kommunikation innerhalb und zwischen den Arten, die Reaktion auf Hüllstress, der Erwerb von Nährstoffen, der horizontale Gentransfer, die Funktion als „Lockvogel“ sowie die Funktion als öffentliches Gut (für eine detaillierte Beschreibung siehe Kulp und Kuehn, 2010 und Schwechheimer und Kuehn, 2015). Im Allgemeinen scheinen OMVs das Überleben des Bakteriums in einer bestimmten Umweltnische zu fördern, was ihre Bedeutung für die bakterielle Homöostase unterstreicht.
Abb. 4. Äußere Membranvesikel von Gram-negativen Bakterien. (A) Darstellung eines Außenmembranvesikels (OMV – obere Tafel), das von der bakteriellen Zellhülle (untere Tafel) stammt. Dargestellt sind Details der äußeren Membran (OM) und der inneren Membran (IM), einschließlich der Transmembranproteine. Der periplasmatische Raum, in dem sich die Peptidoglykanschicht (PG) befindet, zeigt lösliche periplasmatische Proteine, fehlgefaltete Proteine und Nukleinsäuren. Der Inhalt des OMV veranschaulicht einen Teil der Biomoleküle, die sowohl auf der Membran als auch im Lumen identifiziert wurden. (B und C) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen einer mit Uranylacetat negativ gefärbten Zelle von Synechocystis sp. PCC 6803, die ein OMV freisetzt (B, 120.000-fache Vergrößerung), und zellfreies konzentriertes extrazelluläres Medium von Synechocystis sp. PCC 6803, das mehrere OMVs zeigt (C, 40.000-fache Vergrößerung).
(A)Basierend auf Jan, A.T., 2017. Outer membrane vesicles (OMVs) of Gram-negative bacteria: a perspective update. Front. Microbiol. 8, 1053.
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass OMVs mit OM-Komponenten angereichert sind, nämlich LPS und OMPs sowie periplasmatische Proteine, PG-Fragmente und sogar Zytoplasma und Nukleinsäuren (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). In früheren Berichten wurde nicht wirklich zwischen künstlich in Lösung gebildeten MVs (aufgrund des natürlichen Lipidverhaltens der Umgruppierung in Vesikel, die unterschiedslos Material aus der bakteriellen Lyse einschließen) und intakten OMVs unterschieden. In jüngerer Zeit haben verbesserte Isolierungsmethoden und modernste Omics-Techniken eine sorgfältige Analyse der Zusammensetzung der OMVs ermöglicht. Bemerkenswerterweise sind OMVs tatsächlich mit bestimmten zellulären Komponenten angereichert, während sie in anderen verarmt sind (Lee et al., 2008), was die Idee unterstützt, dass die Auswahl der Ladungsinhalte kein zufälliger Prozess ist. So variierte beispielsweise der Gehalt an OMVs von Salmonella sp. je nach den getesteten Wachstumsbedingungen: In OMVs, die aus Zellen unter nährstoffreichen Bedingungen isoliert wurden, wurden bevorzugt zytosolische Proteine nachgewiesen, die an der Translation und dem zellulären Stoffwechsel beteiligt sind, während OMVs unter nährstoffarmen Bedingungen mit Membranproteinen angereichert waren, die am Nährstofftransport beteiligt sind (Bai et al., 2014). Darüber hinaus zeigte ein massenspektrometriebasierter Ansatz, dass in OMVs keine weitgehend konservierte spezifische Komponente nachgewiesen wurde (Schwechheimer et al., 2013), was wiederum auf eine variable Zusammensetzung hindeutet. Insgesamt wird erwartet, dass die unterschiedliche Zusammensetzung der OMVs sowohl mit stammabhängigen Besonderheiten der Zellhülle als auch mit unterschiedlichen ökologischen Nischen zusammenhängt (Yoon, 2016).
Es wurden drei sich nicht ausschließende Mechanismen zur Bildung von OMVs vorgeschlagen. In einem Modell kommt es zur Vesikulation, wenn kovalente Querverbindungen zwischen Membranproteinen und der PG-Schicht lokal gebrochen werden, entweder durch eine vorübergehende Verringerung der Gesamthäufigkeit der Querverbindungen oder durch eine lokale Verschiebung der Querverbindungen, was die Ausbeulung kleiner OM-Abschnitte fördert. Ein anderes Modell geht von periplasmatischen Nanoterritorien aus, in denen sich fehlgefaltete Proteine und andere Hüllkomponenten (LPS oder PG-Fragmente) ansammeln. Nach dieser anormalen, begrenzten Anhäufung zellulärer Komponenten nimmt die Integrität der Hülle lokal ab, was das Aufblähen der mit Lumeninhalten beladenen OM-Abschnitte auslöst. Schließlich wurde auch vorgeschlagen, dass besondere biophysikalische Eigenschaften bestimmter OM-Lipide die Vesikulation fördern können, indem sie die spezifische Integration von LPS oder Phospholipiden bestimmen, was zu Veränderungen der Membranfluidität und -flexibilität führt. Es wird auch davon ausgegangen, dass viele andere Faktoren die Größe, Produktionsrate und Zusammensetzung von OMVs beeinflussen, und wenn es einen einheitlichen OMV-Biogeneseprozess gibt, ist er nicht vollständig charakterisiert (Kulp und Kuehn, 2010; Schwechheimer und Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
In der Cyanobakterienforschung ist das Gebiet der OMVs noch recht jung, und vieles muss noch erforscht werden. Dies wird besonders deutlich durch die Tatsache, dass die früheste Veröffentlichung, die sich ausschließlich mit der Untersuchung von cyanobakteriellen OMVs befasst, aus dem Jahr 2014 stammt (Biller et al., 2014). In dieser bahnbrechenden Studie wird nicht nur gezeigt, dass im Labor kontrollierte Kulturen des marinen Cyanobakteriums Prochlorococcus kontinuierlich OMVs freisetzen, sondern auch, dass diese Vesikel reichlich in Meerwasserproben gefunden werden können. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass OMVs von Prochlorococcus das Wachstum heterotropher Bakterienkulturen unterstützen können, was auf eine Beteiligung dieser Strukturen an den Kohlenstoffflüssen im Meer hindeutet. Darüber hinaus wurden Interaktionen zwischen Phagen und Vesikeln beobachtet, die das Potenzial von OMVs als „Lockvögel“ aufzeigen. Insgesamt veranschaulichten die Autoren einige der grundlegenden Funktionen von OMVs und ihre unzähligen Auswirkungen auf mikrobielle Ökosysteme (Biller et al., 2014). In einer neueren Veröffentlichung wurden die OMVs von Prochlorococcus mit denen von drei anderen marinen Heterotrophen verglichen, um die Häufigkeit der DNA-Verpackung in Vesikeln und die Unterschiede zwischen den verschiedenen Taxa aufzudecken (Biller et al., 2017). Durch die Untersuchung der Menge und Verteilung der mit OMVs assoziierten DNA wurde gezeigt, dass die DNA innerhalb und zwischen OMVs-Populationen unterschiedlich eingekapselt ist. Noch entscheidender ist, dass diese Arbeit darauf hindeutet, dass der Mechanismus, der die DNA in OMVs verpackt, nicht bei allen Bakterien gleichermaßen funktioniert (Biller et al., 2017). Neben Prochlorococcus und den marinen Synechococcus-Stämmen wurde auch bei anderen Cyanobakterien gezeigt, dass sie OMVs bilden und freisetzen, darunter die einzelligen Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) und Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), die filamentöse Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al., 2017) und die filamentösen, Heterozysten bildenden Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) und Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Neben den oben beschriebenen Funktionen für von marinen Cyanobakterien stammende OMVs (Biller et al., 2014) wurden auch andere Funktionen für diese extrazellulären Vesikel vorgeschlagen. Die Freisetzung von OMVs durch Cyanobakterien könnte als effektiver Sekretionsweg dienen. Ein metabolisch veränderter Stamm von Synechococcus sp. PCC 7002, dem zwei Glykogensynthase-Gene, glgA-I und glgA-II, fehlen, setzt nachweislich deutlich mehr OMVs frei als der Wildtyp-Stamm (Xu et al., 2013). Die Autoren stellten die Hypothese auf, dass die beobachteten OMVs mit diesem Sekretionsmechanismus zusammenhängen könnten, da bei dieser Mutante beobachtet wurde, dass sie spontan lösliche Zucker in das Medium exportiert, auch wenn der Zuckergehalt der beobachteten OMVs nicht bewertet wurde (Xu et al., 2013). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein Synechocystis sp. PCC 6803-Stamm, dem das TolC-Homolog fehlt (essenziell für membranabhängige Sekretionsmechanismen; siehe Abb. 1 und 3), deutlich mehr OMVs freisetzt als der Elternstamm (Oliveira et al., 2016). Da der tolC-Knockout in der Sekretion von intrazellulären Proteinen, Metaboliten und exogenen Verbindungen stark beeinträchtigt war, wurde vorgeschlagen, dass die Hypervesikulation den Bedarf an Sekretion erfüllen könnte. In Übereinstimmung damit wurde vorgeschlagen, dass cyanobakterielle OMVs auch Material transportieren, das für die Biofilmentwicklung notwendig ist. Dies wurde aufgrund der Beobachtung von aus Cyanobionten stammenden Vesikeln im Sporokarp des Wasserfarns Azolla microphylla vorgeschlagen (Zheng et al., 2009). Da Berichten zufolge genetisches Material in diesen Vesikeln beobachtet wurde, könnten sie Vektoren für den lateralen Gentransfer zwischen dem Cyanobionten und dem Farn sein (Zheng et al., 2009). Cyanobakterielle OMVs können jedoch auch als Mechanismus zur Ableitung von Hüllstress dienen: Gonçalves et al. charakterisierten eine Reihe von Synechocystis sp. PCC 6803-Stämmen, denen mehrere IM-Translocase-Komponenten fehlen, die an TolC-abhängigen Sekretionssystemen beteiligt sind (Gonçalves et al., 2018). Interessanterweise war unter den verschiedenen Stämmen, die unterschiedliche Kapazitäten zur Freisetzung von OMVs aufwiesen, der TolC-Knockout (der höchste OMV-Produzent in der Studie) der einzige, der bemerkenswert hohe Transkriptspiegel von Spy und DegQ, die für Proteine kodieren, die an Hüllstressreaktionen beteiligt sind, und eine Überexpression von Spy und DegP zeigte (Gonçalves et al., 2018). Die Autoren schlugen daher vor, dass die Deletion von tolC Hüllenstress auslöst und dass die Hypervesikulation im tolC-Knockout einen unabhängigen Mechanismus darstellt, um mit solchen Stressbedingungen umzugehen (Gonçalves et al., 2018).