Albers-Schönberg-Krankheit (autosomal dominante Osteopetrose, Typ II) resultiert aus Mutationen im Chloridkanal-Gen ClCN7

Abstract

Die Albers-Schönberg-Krankheit oder autosomal-dominante Osteopetrose, Typ II (ADO II), ist die häufigste Form der Osteopetrose, einer Gruppe von Erkrankungen, die durch eine erhöhte Skelettmasse aufgrund einer gestörten Knochen- und Knorpelresorption gekennzeichnet ist. Nach der Zuordnung des Gens, das ADO II verursacht, zum Chromosom 16p13.3 berichten wir nun über sieben verschiedene Mutationen in dem Gen, das für den Chloridkanal ClCN7 kodiert, in allen 12 analysierten ADO II-Familien. Darüber hinaus wurde ein Patient mit der schweren, autosomal rezessiven, infantilen Form der Osteopetrose (ARO) identifiziert, der homozygot für eine ClCN7-Mutation ist. Aus den Genotyp-Phänotyp-Korrelationen geht hervor, dass ADO II einen dominant-negativen Effekt widerspiegelt, während Funktionsverlustmutationen in ClCN7 bei heterozygoten Individuen keine Anomalien verursachen. Da einige ARO-Patienten Mutationen in beiden Kopien des ClCN7-Gens aufweisen, ist ADO II bei einer Untergruppe der ARO-Fälle allelisch.

Eingegangen am 2. Oktober 2001; Überarbeitet und angenommen am 11. Oktober 2001.

EINFÜHRUNG

In der Gesundheit resultiert der Umbau des Knochengewebes aus den ausgewogenen Prozessen der Knochenbildung und -resorption. Eine übermäßige Resorption verursacht Osteoporose, die für die meisten nichttraumatischen Frakturen verantwortlich ist (1). Umgekehrt verursacht eine mangelhafte Knochenresorption eine Osteopetrose, die durch dichte, aber meist brüchige Knochen gekennzeichnet ist. Beim Menschen sind mindestens acht Arten von Osteopetrose beschrieben worden (2). Ein Mangel des Isoenzyms der Kohlensäureanhydrase II verursacht eine autosomal rezessive Osteopetrose (ARO) mit renaler tubulärer Azidose und zerebralen Verkalkungen (3; MIM 259730), während die Mehrzahl der Fälle von maligner ARO (4; MIM 259700) auf Mutationen im TCIRG1-Gen zurückzuführen ist (5,6). Einige seltene Fälle von Osteopetrose, die offenbar autosomal rezessiv vererbt werden, weisen einen milderen Phänotyp auf und werden daher als „intermediäre“ Form bezeichnet (7,8; MIM 259710).

Die autosomal dominante Osteopetrose (ADO) ist viel häufiger als ihre rezessiven Gegenstücke (9). Aufgrund ihres relativ gutartigen klinischen Bildes, bei dem viele Patienten asymptomatisch sind und nur durch eine zufällige Röntgenuntersuchung entdeckt werden, wird die Prävalenz der ADO jedoch unterschätzt. Bei Familien mit ADO werden im Allgemeinen zwei Subtypen unterschieden, die in erster Linie auf röntgenologischen Merkmalen beruhen (10,11). Typ I (ADOI) weist eine generalisierte, diffuse Osteosklerose auf, die vor allem das Schädelgewölbe betrifft (11). Typ II (ADO II; MIM 166600), die ursprünglich 1904 von Albers-Schönberg (12) beschriebene Form, ist die häufigste Form mit einer geschätzten Prävalenz von bis zu 5,5/100 000 (13). Zu den klinischen Manifestationen gehören nicht-traumatische Frakturen, insbesondere der langen Knochen, Hirnnervenlähmungen, Osteoarthritis der Hüfte und Osteomyelitis des Unterkiefers (14). ADO II manifestiert sich röntgenologisch mit einer segmentären Osteosklerose, vorwiegend an den Wirbelendplatten („Rugger-Jersey-Wirbelsäule“), den Darmbeinflügeln („Knochen-im-Knochen“-Zeichen) und der Schädelbasis (9) (Abb. 1).

Kürzlich haben wir im Rahmen einer genomweiten Suche ein Gen, das ADO II zugrunde liegt, dem Chromosom 16p13.3 zugeordnet (15). Interessanterweise befindet sich das Gen, das für den Chloridkanal ClCN7 kodiert, innerhalb der Kandidatenregion von 8,4 cM (16). Der Chloridkanal ist für die Ansäuerung der extrazellulären Resorptionslücke, die für den Osteoklasten-vermittelten Abbau von Knochengewebe notwendig ist, unerlässlich (17) und ist bei einem Patienten mit ARO mutiert (17). Daher betrachten wir ClCN7 sowohl als positionelles als auch als funktionelles Kandidatengen für die Verursachung der Albers-Schönberg-Krankheit.

ERGEBNISSE

Mutationsanalyse von ADO II-Familien

Da die genomische Sequenz einschließlich des ClCN7-Gens in Sequenzdatenbanken (GenBank-Zugangsnummern AL031600 und AL031705) verfügbar ist, ist eine Mutationsanalyse der Exons und Intron-Exon-Grenzen unter Verwendung genomischer DNA möglich. Dabei wurden sieben verschiedene Mutationen in ClCN7 (Abb. 2) in 12 nicht verwandten ADO-II-Familien festgestellt (Tabelle 1). Fünf Mutationen sind Missense-Mutationen, eine führt zu einer Deletion einer Aminosäure und eine zu einer Deletion von zwei Nukleotiden, die einen Frameshift verursacht, der das C-terminale Ende des Proteins betrifft. Keine dieser Mutationen wurde in 100 Kontrollchromosomen gefunden.

Vier Mutationen sind redundante Mutationen. Die 2423delAG-Mutation wurde in einer Familie aus Frankreich und in einer amerikanischen Familie identifiziert. Die G215R-Mutation trat in einer französischen, einer dänischen und einer amerikanischen Familie auf. Die P249L-Mutation wurde in einer französischen und in einer deutschen Familie gefunden. Die R767W-Mutation schließlich wurde in einer französischen und einer amerikanischen Familie festgestellt (Tabelle 1). Die unterschiedliche geografische Herkunft der untersuchten Familien sowie die Analyse der Mikrosatellitenmarker, die das ClCN7-Gen flankieren (Daten nicht gezeigt), deuten darauf hin, dass es sich um unabhängige Mutationen handelt, d. h. dass sie nicht von einem gemeinsamen Vorfahren vererbt wurden.

Mutationsanalyse eines ARO-Patienten

Die Verknüpfungsanalyse mit Markern von Chromosom 16p13.3 zeigte eindeutig Homozygotie für alle Marker bei einem ARO-Patienten, der von blutsverwandten, gesunden Eltern stammt (Daten nicht gezeigt). Daher wurde eine Mutationsanalyse von ClCN7 durchgeführt, die eine homozygote Missense-Mutation an Position 766 (L766P) ergab (Abb. 2). Beide Eltern sind heterozygot für diese Mutation.

Position und Erhaltung der mutierten Aminosäuren

Die für die ClC-Chloridkanäle vorgeschlagene Transmembrantopologie legt 10-12 Transmembrandomänen nahe (18). Die fünf Aminosäuren, die an den ADO II-Missense-Mutationen beteiligt sind, sowie die Mutation, die bei dem ARO-Patienten auftrat, sind alle unter den verschiedenen Mitgliedern der ClC-Chloridkanal-Genfamilie hoch konserviert (Abb. 3). Bei den Mutationen G215R und P249L handelt es sich um wiederkehrende Mutationen, die bei Patienten in drei bzw. zwei nicht verwandten Familien gefunden wurden (Tabelle 1). G215 ist ein hochkonservierter Rest, der sich zwischen D2 und D3 befindet (Abb. 4), einer Region, von der bekannt ist, dass sie die Poreneigenschaften der Kanäle beeinflusst (19), während P249 an einem hochkonservierten Strukturelement beteiligt ist, das einen wesentlichen Teil der ClC-Kanalpore bildet (20). R286 befindet sich im extrazellulären Raum, direkt außerhalb der Transmembrandomäne D5. Diese Aminosäure ist bei den verschiedenen ClC-Proteinen konserviert, mit Ausnahme von ClC1 und ClC2, die in diesem Bereich des Proteins eine divergierende Sequenz aufweisen. Die beiden übrigen ADO-II-Mutationen und die ARO-Mutation befinden sich im zytosolischen, C-terminalen Teil des Proteins und betreffen benachbarte Aminosäuren. G765, L766 und R767 befinden sich innerhalb der D13-Strecke, die mit der zweiten CBS-Domäne (Cystathionin-β-Synthase) zusammenfällt, die im CLCN7-Protein beschrieben wurde (21). Alle drei Mutationen befinden sich innerhalb des β2-Strangs der CBS-Domäne, von der berichtet wurde, dass Mutationen beim Menschen Krankheiten verursachen (22). Die genaue Funktion dieser Domäne ist noch unklar, aber es wurde eine Rolle bei der Proteinsortierung vermutet (21).

Schließlich betreffen die beiden kleinen Deletionen Aminosäuren aus dem intrazellulären C-terminalen Teil von ClCN7. Die Aminosäure L688, die bei einem Patienten deletiert wurde, befindet sich zwischen den beiden CBS-Domänen, während die Deletion von zwei Nukleotiden ab der Nukleotidposition 2423 bei zwei nicht verwandten Familien zu einem Protein führt, das sich nur in den letzten 10 Aminosäuren vom Wildtyp ClCN7 unterscheidet.

DISKUSSION

Osteopetrosen bei Säugetieren stellen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen dar, zu denen mindestens acht verschiedene klinische Entitäten beim Menschen (2) und etwa neun spontane Tiermutanten (23) gehören. Darüber hinaus verursachen Knockout-Mausmodelle für mehrere Gene osteopetrotische Phänotypen, was die Vielfalt der Faktoren verdeutlicht, die an der Osteoklastendifferenzierung und -aktivierung beteiligt sind (23).

Kürzlich wurde die Heterogenität menschlicher Osteopetrosen durch genetische Heterogenität sogar innerhalb des ADO-II-Subtyps unterstrichen (24,25). Diese Erkenntnis beruhte auf einer Linkage-Studie an einer dänischen Großfamilie, bei der das ADO II-Gen dem Chromosom 1p21 zugeordnet wurde (26). Diese Zuordnung wurde jedoch in Studien an anderen ADO-II-Familien nicht bestätigt. In unserer jüngsten Linkage-Studie, die sechs ADO-II-Familien umfasste, lokalisierten wir das krankheitsverursachende Gen auf Chromosom 16p13.3 und fanden in derselben dänischen Familie eine Kosegregation zwischen ADO II und einem Haplotyp auf Chromosom 16p13.3 (15). Daher vermuteten wir, dass der Nachweis der Bindung an Chromosom 1p21 in dieser Familie eine zufällige Kosegregation widerspiegelt. In der aktuellen Studie bestätigten wir diese Hypothese, indem wir eine krankheitsverursachende Mutation (G215R) im ClCN7-Gen in dieser dänischen Familie identifizierten. Dies und die Tatsache, dass Mutationen in diesem Gen in allen 12 analysierten ADO-II-Familien gefunden wurden, deutet darauf hin, dass ADO II genetisch homogen ist.

Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass ADO II mit einer Untergruppe von Patienten mit der schweren, autosomal rezessiven, infantilen Form der Osteopetrose allelisch ist. Zuvor war ein ARO-Patient als Compound-Heterozygote für eine Nonsense-Mutation (Q555X) und eine Missense-Mutation (R762Q) im ClCN7-Gen beschrieben worden (17). Bei einem weiteren ARO-Patienten haben wir nun eine homozygote Mutation (L766P) gefunden.

Abbildung 5 veranschaulicht unsere Korrelation zwischen den verschiedenen Genotypen und Phänotypen. Wie der Phänotyp der ClC-7-Knockout-Maus zeigt, führt ein vollständiger Funktionsverlust des ClC-7-Chloridkanals zu einer schweren Osteopetrose, wie sie bei ARO-Patienten auftritt. Da ClCN7-Mutationen bisher nur bei zwei ARO-Patienten charakterisiert wurden, ist es unmöglich zu wissen, ob die phänotypischen Unterschiede die Art der Mutationen widerspiegeln. Einige seltene Fälle von Osteopetrose weisen eine „intermediäre“ Form auf. In diesen Fällen wird ein autosomal rezessiver Vererbungsmodus vorgeschlagen, aber der Phänotyp ist milder als bei ARO (7,8). Möglicherweise handelt es sich in diesen Fällen um Kombinationen von zwei Mutationen in ClCN7, die jeweils die Kapazität für die Cl-Leitung nur geringfügig reduzieren.

Bei den hier berichteten ADO II-Mutationen handelt es sich in erster Linie um Missense-Mutationen, die konservierte Aminosäuren betreffen (Abb. 3 und 4). Bei den beiden verbleibenden Mutationen handelt es sich um kleine Deletionen, die ebenfalls die Hauptanatomie des Chloridkanals bewahren und daher höchstwahrscheinlich zu vergleichbaren Effekten wie die Missense-Mutationen führen. Da Chloridkanäle offenbar als Multimere, wahrscheinlich Dimere (27), organisiert sind, beeinträchtigen diese Mutationen wahrscheinlich ihre Funktion durch dominant negative Effekte. Mit solchen Effekten werden die meisten Chloridkanäle nicht funktionieren, was die phänotypischen Anomalien erklärt.

Im Allgemeinen sind die Eltern von ARO-Patienten phänotypisch normal. Wir nehmen an, dass dies die Tatsache widerspiegelt, dass eine Haploinsuffizienz für dieses Gen höchstwahrscheinlich keine klinischen Komplikationen oder radiologischen Befunde verursacht. In einigen Fällen kann dies aber auch auf die geringere Penetranz von ADO II zurückzuführen sein. Die Eltern des in dieser Studie vorgestellten ARO-Patienten haben keine klinischen Symptome von ADO II, aber eine radiologische Untersuchung war nicht verfügbar.

Die allelische Natur von ADO II und ARO wird durch einen Bericht über eine Großfamilie mit segregierender ADO II unterstützt, in der ein Individuum ARO manifestierte (28). Möglicherweise verursacht in dieser Familie ein mutiertes ClCN7-Gen mit dominant-negativer Wirkung ADO II, das dann mit einer de novo-Mutation oder einer vom zweiten Elternteil geerbten Mutation, die ARO verursacht, zusammenfällt. Die vorgeschlagene Erklärung für die dominanten und rezessiven Formen der Osteopetrose, die mit ClCN7-Mutationen einhergehen, ähnelt den Mutationen im ClC-1-Gen, die Myotonie verursachen. Mutationen, die zum Verlust von ClC-1 führen, verursachen die autosomal rezessive Form (Becker-Typ) (29), während Missense-Mutationen die weniger schwere, autosomal dominante Form (Thomsen-Typ) verursachen (30).

Zusammenfassend zeigen wir, dass die meisten, wenn nicht alle Fälle von ADO II durch Mutationen im ClCN7-Gen verursacht werden. Aufgrund der Art der ClCN7-Mutationen resultiert der ADO II-Phänotyp wahrscheinlich aus einem dominanten negativen Effekt. Unsere Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Chloridkanäle im Allgemeinen als Homomultimere auftreten. Darüber hinaus veranschaulicht unsere Studie die allelische Natur von ADO II und einer Untergruppe von ARO-Fällen.

MATERIALIEN UND METHODEN

Familien und Patienten

Die Familien A-F wurden zuvor beschrieben, da sie zur Lokalisierung des Gens der Albers-Schönberg-Krankheit auf Chromosom 16p13.3 verwendet wurden (15). Die Proben G-L stammen von betroffenen Personen aus Familien mit einer Vorgeschichte der Albers-Schönberg-Krankheit, von denen ebenfalls mehrere beschrieben wurden (31-33) (Tabelle 1).

Familie M lebt in den Vereinigten Staaten, ist aber chinesischer Abstammung. Das vorgeschlagene Kind ist das Kind eines gesunden Paares und wurde nach einer voll ausgetragenen Schwangerschaft geboren. Die Eltern sind Cousins und Cousinen zweiten Grades. ARO wurde im Alter von 3 Monaten diagnostiziert, als sie mit einer Bell-Lähmung in das New York Hospital Medical Center of Queens eingeliefert wurde. Die Röntgenuntersuchung des Skeletts ergab eine schwere Osteopetrose und mehrere nicht verschobene Schrägfrakturen. Sie hatte eine Anämie, Retikulozytose, Hepatosplenomegalie und eine leichte Atrophie des Sehnervs. Das Kind unterzog sich einer unpassenden allogenen Knochenmarktransplantation, starb jedoch im Alter von 18 Monaten an Sepsis und Atemversagen.

Mutationsanalyse

Die DNA wurde mit Standardverfahren aus Blut isoliert. Intron-Primer (Tabelle 2), die alle kodierenden Exons und Intron-Exon-Grenzen von ClCN7 amplifizieren, wurden aus genomischen Sequenzen (GenBank-Hinterlegungsnummern AL031600 und AL031705) entwickelt. Die 25 Exons wurden aus genomischer DNA mit Taq-Polymerase oder mit dem PCR-Enhancer-System (Gibco BRL) bei einer Enhancer-Konzentration von 1× amplifiziert. Für alle Amplifikationen wurden 30 Zyklen bei einer in Tabelle 2 angegebenen Temperatur durchgeführt.

Die PCR-Produkte wurden mit dem Concert Rapid PCR purification system (Life Technologies) gereinigt und direkt mit den für die Amplifikation verwendeten Primern sequenziert, wobei Big-Dye terminator chemistry (Perkin-Elmer) auf einem ABI 3100 automatisierten Sequenzer verwendet wurde. Die Amplifikation von Exon 9 führte zu einem Fragment mit variabler Länge, da dieses Exon einer Tandemwiederholung einer 50 bp-Sequenz mit variabler Kopienzahl folgt. In unserem Probensatz variierte die Kopienzahl zwischen vier und sieben Wiederholungen. Dieser Repeat stört in einigen Proben auch die Sequenzierung dieses Exons in Vorwärtsrichtung.

Alle Exons, in denen mutmaßliche Mutationen entdeckt wurden, wurden in 100 Kontrollchromosomen sequenziert, ohne dass die Mutationen gefunden wurden.

HINWEISE

Wir danken den Patienten und Familien sowie den Klinikern, die Material zur Verfügung gestellt haben. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss (G.0404.00) des „Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek“ (FWO) an W.V.H. Diese Forschung wurde auch durch Zuschüsse der „Société Française de Rhumatologie“ (SFR), des „Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris“ (FERCMHP) und des Shriners Hospital for Children (Nr. 8540) unterstützt.